[发明专利]用于检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒和方法

说明书

本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒和方法，包含两组用于检测新型冠状病毒核酸的引物和探针和一组内控引物和探针，所述探针I和引物对I的检测通道为FAM，所述探针II和引物对II的检测通道为VIC，所述内控引物和探针的检测通道为CY5。本发明所述试剂盒通过在检测体系中引入多个标记位点进行多重荧光标记，多重数字PCR体系同时检测多个新型冠状病毒位点，提高检测精准度。本发明所述试剂盒具有高灵敏性和特异性，能够检测到低至5copies/反应的阳性，避免了荧光定量可能出现的假阴性；同时设置两个检测通道和一个内控通道，避免了加样过程中可能造成的污染。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒、方法和应用。

背景技术

2019新型冠状病毒（COVID-19）于2020年1月12日被世界卫生组织命名。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。开发检测新冠病毒的试剂盒所需要的分子诊断技术相对成熟，但是现在市场上试剂盒的检测高灵敏度、高特异性是需要进行改进和提升的。

现有的核酸检测方法，通常是提取RNA后，采用一步法荧光定量PCR技术检测单个基因位点，这样就会造成平台检测的灵敏度不高，容易造成漏检，出现假阴性，且现有荧光定量检测通常只能做到两个荧光通道同时检测，无法兼顾内控通道；或者检测两份，即分别采用两个基因和一个内控基因构成检测体系。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明旨在开发一种用于检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒、方法和应用，所述试剂盒能够保证检测的高灵敏性和特异性，能够检测到低至5copies/反应的阳性，避免了荧光定量可能出现的假阴性；同时进行两个检测通道和一个内控通道的检测，避免了加样过程中可能造成的污染。

数字PCR技术是一种核酸分子绝对定量技术。数字PCR过程至少包含3个主要环节，即样本的分散、PCR扩增、荧光信号的采集与数据分析。即将1个样本稀释并分成数百个甚至数百万个独立的反应单元，使每个反应单元中包含或者不包含1个或多个拷贝的目标分子，进而对所有独立的反应单元进行平行扩增，扩增结束后读取各个反应单元的阴性或阳性荧光信号，并根据泊松分布原理，计算出原始样本的拷贝数。本发明通过在体系中引入多个标记位点，进行多重荧光标记，多重数字PCR体系同时检测多个新型冠状病毒位点，提高检测结果的精准度。

本发明采用的技术方案为：

一种用于检测新型冠状病毒的引物探针组合，包含两组用于检测新型冠状病毒核酸的引物和探针：探针I的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物对I的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；探针II的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，引物对II的序列如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示；

还包含一组内控引物和探针：内控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，内控引物对的序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。

进一步地，所述探针I和引物对I的检测通道为FAM，所述探针II和引物对II的检测通道为VIC，所述内控引物和探针的检测通道为CY5。

进一步地，所述引物的工作浓度为800-1200nM，所述探针的工作浓度为150-250nM。

进一步地，两组用于检测新型冠状病毒核酸的引物和探针用于检测新型冠状病毒核酸的2个保守区M基因片段和Rdrp基因片段。

一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，含有所述的用于检测新型冠状病毒的引物探针组合：探针I、引物对I、探针II、引物对II及内控引物和探针。

进一步地，所述试剂盒还包括反应缓冲液、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、ROX染料、内控引物探针组、内控DNA和无核酸酶水。