[发明专利]一套抑制AMH基因表达的反义RNA及促进罗非鱼雄鱼性腺退化和提高增重的方法

说明书

本发明提供了一套抑制AMH基因表达的反义RNA及促进罗非鱼雄鱼性腺退化和提高增重的方法，属于水产育种技术领域。抑制AMH基因表达的反义RNA，包括反义RNA1和反义RNA2，可以精确地抑制抗缪勒氏管激素基因mRNA的转录水平，干扰其mRNA转运与翻译，进而影响其蛋白表达水平。本发明还提供了一种促进罗非鱼雄鱼性腺退化和提高增重的方法，采用反义RNA序列导入技术将两条反义RNA导入卵子中，对卵子损伤较小，成功率高。所述方法可以有效进行目标基因研究与抗病促生长新品种的开发，具有极强的应用前景。

技术领域

本发明属于水产育种技术领域，具体涉及一套抑制AMH基因表达的反义RNA及促进罗非鱼雄鱼性腺退化和提高增重的方法。

背景技术

罗非鱼在我国南方地区广泛养殖，年产量超过140万吨，位居全球第一位。养殖过程中，养殖户偏爱养殖雄性罗非鱼。因为在性成熟前，雄性罗非鱼与雌性罗非鱼生长没有差异。然而，在性成熟后，雌鱼卵巢发育过程中需要消耗大量的营养物质，孵化期间完全停止摄食；在护养幼鱼期间摄食也很少；且一年繁殖几次，生长显著减慢。因而，罗非鱼雄鱼的生长速度比雌鱼快30％以上。

抗缪勒氏管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)基因在哺乳动物雄性性腺分化期抑制缪勒氏管形成，阻止雌性生殖管发育，使中肾管发育成附睾、输精管和精囊。AMH基因在鱼类精巢中的表达显著高于卵巢，表明其是雄性发育过程的重要基因。

目前，常用的基因编辑技术主要有锌指核酸酶与人工核酸内切酶技术，这些技术进行基因编辑时，脱靶的可能性极大，造成相邻基因的变异，带来不可预估的风险。同时，转染时需要通过显微注射。鱼类受精卵卵壳较厚，内压较大，因此，显微注射时卵壳极易破碎，成功率极低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一套抑制AMH基因表达的反义RNA，通过抑制罗非鱼雄鱼生长阶段AMH基因的蛋白表达水平，达到促进雄性性器官退化的目的。

本发明的目的还在于提供一种促进罗非鱼雄鱼性腺退化和提高增重的方法，该方法对受精卵无任何伤害，成功率极高，提高罗非鱼养殖经济效益。

本发明提供了一套抑制AMH基因表达的反义RNA，包括反义RNA1和反义RNA2；

所述反义RNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述反义RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种促进罗非鱼雄鱼性腺退化和提高增重的方法，包括以下步骤：

1)人工合成所述反义RNA，分别克隆至含CMV启动子的pcDNA3.1表达载体中XhoⅠ与XbaⅠ的位点之间，得到pcDNA3.1-反义RNA1和pcDNA3.1-反义RNA2；

2)以所述pcDNA3.1-反应RNA1或pcDNA3.1-反应RNA2为模板，用PolyAF2和polyAR1进行PCR扩增，得到含CMV启动子和反义RNA1的扩增产物1或含CMV启动子和反义RNA2的扩增产物2；

所述PolyAF2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述polyAR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

3)将所述扩增产物1、扩增产物2、阳离子脂质体Lipofecter和精子保存液混合，得到转染试剂；

4)从性腺发育成熟的罗非鱼雌鱼中取成熟卵子，将所述成熟卵子与营养盐溶液混合，加入所述转染试剂，轻轻摇晃混合液，得到含有反义RNA的卵子；

所述营养盐溶液包括氯化钠4～8g/L、氯化钾0.1～0.2g/L、氯化钙0.05～0.12g/L、碳酸氢钠0.05～0.15g/L、磷酸二氢钠0.1～0.2g/L和葡萄糖0.5～1.5g/L；