[发明专利]一套抑制AMH基因表达的反义RNA及促进罗非鱼雄鱼性腺退化和提高增重的方法

权利要求书

1.一套抑制AMH基因表达的反义RNA，其特征在于，包括反义RNA1和反义RNA2；

所述反义RNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述反义RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种促进罗非鱼雄鱼性腺退化和提高增重的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将人工合成的权利要求1所述反义RNA分别克隆至含CMV启动子的pcDNA3.1表达载体中XhoⅠ与XbaⅠ的位点之间，得到pcDNA3.1-反义RNA1和pcDNA3.1-反义RNA2；

2)以所述pcDNA3.1-反应RNA1或pcDNA3.1-反应RNA2为模板，用PolyAF2和polyAR1进行PCR扩增，得到含CMV启动子和反义RNA1的扩增产物1或含CMV启动子和反义RNA2的扩增产物2；

所述PolyAF2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述polyAR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

3)将所述扩增产物1、扩增产物2、阳离子脂质体Lipofecter和精子保存液混合，得到转染试剂；

4)从性腺发育成熟的罗非鱼雌鱼中取成熟卵子后，将所述成熟卵子与营养盐溶液混合，加入所述转染试剂，轻轻摇晃混合液，得到含有反义RNA的卵子；

所述营养盐溶液包括氯化钠4～8g/L、氯化钾0.1～0.2g/L、氯化钙0.05～0.12g/L、碳酸氢钠0.05～0.15g/L、磷酸二氢钠0.1～0.2g/L和葡萄糖0.5～1.5g/L；

5)将所述含有反义RNA的卵子和新鲜精液混合进行人工受精，得到的受精卵进行人工孵化。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增的反应体系为50μl，包含2×Mastermix 25μl，引物5μl，超纯水18μl，模板2μl；所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，34个循环；72℃延长5min。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)中所述扩增产物1、扩增产物2、阳离子脂质体Lipofecter和精子保存液的体积比为1:1:2:31；

所述精子保存液为包含质量浓度4％蔗糖、体积浓度3％甘油和体积浓度1％DMSO的水溶液。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)中每100粒成熟卵子用1.2～2ml营养盐溶液处理。

6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)中每100粒所述成熟卵子添加0.8～1.5ml转染试剂。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)中所述摇晃混合液的时间为12～20min。

8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤5)中每100粒成熟卵子添加0.1～0.2ml新鲜精液进行人工受精。

9.根据权利要求2或7所述方法，其特征在于，步骤5)中所述人工受精为成熟卵子和新鲜精液混合后，使用羽毛搅动30～40s，加入2ml孵化用水。

10.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤6)中所述人工孵化时，水温为27～29℃，水流速度为5～8升/分钟。