[发明专利]外泌体在细胞外基质中的富集方法、富含外泌体的ECM生物材料与应用

说明书

本发明公开了一种外泌体在细胞外基质中的富集方法、富含外泌体的ECM生物材料与应用。本发明还公开了一种CBD‑LAMP 2b融合基因。含有前述CBD‑LAMP 2b融合基因的细胞系能够稳定表达CBD‑LAMP 2b蛋白，并能够稳定分泌结合到细胞外基质上的外泌体，实现外泌体在细胞外基质中的富集。所述ECM生物材料由前述细胞系合成并分泌到胞外。本发明构建了携带有胶原结合区域CBD的LAMP 2b融合蛋白，进而使外泌体具有结合到ECM成分之一胶原I上的能力，ECM生物海绵实现了对于外泌体的抓取和富集，并且采用反复冻融的方式制备富含外泌体的ECM生物材料，其可以作为药物或miRNA载体，实现对于疾病的药物递送。

技术领域

本发明涉及一种外泌体在细胞外基质中的富集方法，具体涉及一种利用胶原结合域多肽（Collagen Binding Domain, CBD）实现外泌体在细胞外基质中富集的技术方法，以及制备富含大量外泌体的细胞外基质生物材料及其应用，属于生物材料及基因工程技术领域。

背景技术

外泌体（exosome）是由多囊泡体与细胞膜融合形成的直径为50-200 nm的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）（Gurunathan S, Kang M, Jeyaraj M, et al.Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, andMultifarious Therapeutic Approaches of Exosomes.[J]. Cells, 2019, 8(4).），在蔗糖梯度中浮力密度为1.13-1.18 g/ml，在电镜下为具有膜结构的杯形。1983年，外泌体首次在网织红细胞中被发现，随后Rose Johnstone将这类EVs命名为“外泌体”（Harding C V,Heuser J E, Stahl P D, et al. Exosomes: Looking back three decades and intothe future[J]. Journal of Cell Biology, 2013, 200(4): 367-371.）。很长时间外泌体都充当着默默无闻的信息传递者，刚被发现时更是被当成细胞代谢所产生的“排泄物”。但随着外泌体研究的深入，科学家发现外泌体中包含各种生物活性物质，例如：细胞因子、mRNA、miRNA等。这些生物活性物质参与细胞增殖和凋亡、炎症反应、血管生成、纤维化、组织修复等重要生理过程（Gupta K, Goldufsky J W, Wood S, et al. Apoptosis andCompensatory Proliferation Signaling Are Coupled by CrkI-ContainingMicrovesicles[J]. Developmental Cell, 2017, 41(6).；G V N, Dangelo G, RaposoG, et al. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2018, 19(4): 213-228.；ImmunomodulatoryEffects of Mesenchymal Stromal Cells-Derived Exosome.）。目前外泌体收集分离方式主要有五种：①超速离心法；②密度梯度离心法；③共沉淀法；④凝胶组排层析法；⑤场流分级法。在实验研究中外泌体的提取普遍采用超速离心法，并且为了满足用药剂量，需要大规模收集细胞培养上清，这就造成了收集过程复杂和成本较高的问题。因此，如何对外泌体进行简便快速富集成为了一个难题（Shao H, Im H, Castro C M, et al. NewTechnologies for Analysis of Extracellular Vesicles[J]. Chemical Reviews,2018, 118(4): 1917-1950.）。