[发明专利]外泌体在细胞外基质中的富集方法、富含外泌体的ECM生物材料与应用

权利要求书

1.一种CBD-LAMP 2b融合基因，其特征在于，所述CBD-LAMP 2b融合基因的序列如SEQID NO: 1所示。

2. 携带有权利要求1所述的CBD-LAMP 2b融合基因的重组表达载体。

3. 根据权利要求2所述的CBD-LAMP 2b融合基因的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包括重组质粒。

4.转化或转染有权利要求2所述重组表达载体的宿主菌。

5. 含有权利要求1所述的CBD-LAMP 2b融合基因或权利要求2所述的重组表达载体的细胞系，所述细胞系能够稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白，并能够稳定分泌结合到细胞外基质上的外泌体，实现外泌体在细胞外基质中的富集。

6. 一种富含外泌体的ECM生物材料，其特征在于它是由权利要求5所述的细胞系合成并分泌到胞外，且ECM生物材料的富集膜蛋白具有CBD-LAMP 2b的外泌体。

7.根据权利要求6所述的ECM生物材料，其特征在于：所述ECM生物材料为固态ECM生物材料或液态ECM生物材料。

8.权利要求6-7中任一项所述富含外泌体的ECM生物材料在制备药物或者制备miRNA载体中的应用。

9.一种药物组合物，其特征在于包括权利要求6-7中任一项所述的富含外泌体的ECM生物材料。

10.一种外泌体在细胞外基质中的富集方法，其特征在于包括：

（1）用引物通过聚合酶链式反应对LAMP 2b基因的cDNA进行扩增，将CBD基因序列插入到LAMP 2b基因中，获得的CBD-LAMP 2b融合基因的序列如SEQ ID NO: 1所示，再根据引物所选用的酶切位点将扩增出来的基因和原始载体骨架同时进行酶切，之后回收酶切片段，并使酶切片段与载体酶切片段在DNA连接酶的作用下进行酶连反应，酶连反应结束后，酶连产物转化进入感受态细胞中并扩增质粒，之后进行载体测序验证质粒序列的准确性，构建得到重组质粒或重组表达载体；

（2）通过病毒包装体系将重组质粒或重组表达载体整合到细胞基因组中，构建稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白的细胞模型，获得稳转细胞系；

（3）对稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白的细胞系进行培养，细胞同时向胞外分泌ECM和外泌体，细胞分泌的外泌体通过CBD-LAMP 2b蛋白固定到细胞周围的ECM中，实现外泌体的富集。

11. 根据权利要求10所述的富集方法，其特征在于：所述引物的序列分别如SEQ IDNO: 2~SEQ ID NO: 7所示。

12.根据权利要求10所述的富集方法，其特征在于：所述载体骨架包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒的载体。

13. 根据权利要求10所述的富集方法，其特征在于：所述细胞选用间充质干细胞、293T细胞、神经干细胞、脂肪干细胞或NIH 3T3细胞。

14.一种富含外泌体的ECM生物材料的制备方法，其特征在于包括：

按照权利要求10-13中任一项所述方法实现外泌体在细胞外基质中的富集；

以及，采用反复冻融方法制备富含外泌体的ECM生物材料。