[发明专利]一种制备大小均匀的输卵管小体的方法

说明书

本发明公开了一种制备大小均匀的输卵管小体的方法，包括如下步骤：解剖处于发情间期的哺乳动物，获得输卵管及输卵管液；将所述输卵管及输卵管液经常速离心获取上清液；将所述上清液经超速离心，保留沉淀；混悬沉淀于所述适量液体中，收集混悬液，得到大小均匀的输卵管小体。本发明所述的方法获得的输卵管小体大小均匀且粒径约10nm左右，有利于靶细胞快速摄取吸收，能提高其作为药物或药物载体时的疗效；同时能保持输卵管小体所携带的蛋白及miRNA等分子种类及量的生理状态；缩短制备周期，节约时间及劳动力；为输卵管小体进一步应用于制备药物或药物载体、生殖生物学研究应用、生殖医学研究应用提供条件。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种制备大小均匀的输卵管小体的方法。

背景技术

胞外囊泡是由真核细胞和原核细胞产生的具有膜结合特征的磷脂双层结构，可携带并传递各种调节分子，如蛋白质、RNA和脂质等。它们可作为信息交流的一种模式，向靶细胞提供各种调节分子，以实现细胞与细胞间物质或信息交流。胞外囊泡根据直径大小可分为外泌体和微囊泡，小于40～120nm称为外泌体，50nm～1μm为微囊泡。胞外囊泡对正常生理、疾病的发生发展有调控功能，可用于药物载体，具有重要研究价值，同时在生殖生物学领域也得到关注。

胞外囊泡具有纳米材料的优点，包括大小、形状、表面电荷及具有与靶细胞表面配体特异的结合基团等方面。胞外囊泡是细胞来源的膜结构，是一种机体内天然的细胞间交流机制，具有传递功能性生物分子、克服天然屏障、固有细胞的靶向性和在循环系统中稳定等诸多优势，还可被生物降解或代谢，因而，胞外囊泡在作为药物递送载体方面的应用研究愈发受到重视。

雌性生殖道不同部位均有胞外囊泡分泌，包括来源于阴道、子宫、输卵管、卵巢及母胎界面的滋养层细胞，其中来源于阴道、子宫和输卵管也分别被称为阴道小体、子宫小体和输卵管小体。

输卵管小体已被证明存在CD9标志分子和精子功能蛋白SPAM1和PMCA4，输卵管上皮细胞分泌的输卵管小体可以转运钙信号相关蛋白PMCA4给精子，包括人输卵管小体中的磷酸化蛋白也可转运给人精子并被摄取，这些蛋白在精子受精和妊娠早期发挥作用。输卵管小体也携带有多种miRNA，其中最主要的多种miRNA精子中也存在，而且输卵管胞外囊泡也被证明可将miRNA转运给精子。此外输卵管小体还可改善胚胎质量，在体外培养中可诱导冷冻保护，在体内可增加囊胚形成比例、胚胎的存活时间及提高胚胎质量。

但是，输卵管小体作为药物载体仍面临着诸多挑战：例如不同来源的输卵管小体大小不同，携带物质不同，如何将所携带的物质及药物组装进输卵管小体等等。另外，由于输卵管小体被靶细胞摄取吸收是大小依赖性的(Size-dependent cellular uptake ofexosomes[J].Nanomedicine，2017，13(3)：1011-1020.)，如何获得生理状态下的大小更小的输卵管小体更是亟待解决的问题。

现有方法通常用注射激素人工超排非自然的方法获得输卵管小体，这种方法由于人为注射激素会对输卵管小体上所携带的蛋白及miRNA等分子种类及量的造成变化影响；另外超排过程周期长，耗时费力，其大小均匀也是难以控制。

发明内容

本发明提供了一种制备大小均匀的输卵管小体的方法，从阴道分泌物的细胞形态学特征判断，选择发情间期的哺乳动物(小鼠)，从而制备出大小均匀且粒径较小的输卵管小体。

一种制备大小均匀的输卵管小体的方法，包括如下步骤：

S1、解剖处于发情间期的哺乳动物，获得输卵管及输卵管液；

S2、将所述输卵管及输卵管液经常速离心获取上清液；

S3、将所述上清液经超速离心，保留沉淀；混悬沉淀于所述适量液体中，收集混悬液，得到大小均匀的输卵管小体；所述的输卵管小体的粒径为5～15nm。

所述的哺乳动物为小鼠。