[发明专利]EB病毒阴性的NK-92细胞及其制备方法有效

专利信息
申请号: 202010872058.0 申请日: 2020-08-26
公开(公告)号: CN111926016B 公开(公告)日: 2022-12-09
发明(设计)人: 栗凤鹏;曹青;李华顺 申请(专利权)人: 阿思科力(苏州)生物科技有限公司
主分类号: C12N15/113 分类号: C12N15/113;C12N9/20;C12N15/85;C12N5/10
代理公司: 苏州三英知识产权代理有限公司 32412 代理人: 朱如松
地址: 215000 江苏省苏州市*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: eb 病毒 阴性 nk 92 细胞 及其 制备 方法
【说明书】:

发明公开了一种EB病毒阴性的NK‑92细胞及其制备方法,通过基因编辑技术成功去除了NK‑92细胞中携带的EB病毒,获得了EB病毒阴性的NK‑92细胞株;提高了NK‑92细胞的安全性,为后续以NK‑92为基础的免疫细胞药物治疗奠定基础。

技术领域

本发明涉及技术生物医药技术领域,尤其是一种EB病毒阴性的NK-92细胞 及其制备方法。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的重要组成部分,具有抗肿瘤、抗病毒 感染和免疫调节作用。NK细胞一直被认为是杀死癌细胞和治疗感染的绝佳武器。 与T淋巴细胞不同,NK细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞, 是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。人类NK细胞约占全血淋巴细胞的10%~15%。 目前研究认为NK细胞特异性表达CD56,而缺乏T细胞抗原CD3。由于NK细 胞纯化和体外大量扩增存在一定的技术难度。因此科学家试图建立细胞系,用同 种异体NK细胞进行肿瘤生物治疗,目前国内外科学家在NK抗肿瘤研究中已先 后建立HANK、KHYG-1、NK-92、NKL、PLT、MOTN、IMC-1、NK-YS、KAI3、 SNK-1、SNK6以及YT、NK3.3等,还有通过稳定转染IL-2获得的NK-92MI、 IL-2/NKL、IL-2/NK3.3等转基因NK细胞系。而NK-92细胞是1992年建立的 来自非何杰金淋巴瘤患者的NK细胞系,由于其免疫表型为CD56brightCD16-, 无ADCC效应,类似于外周血CD56brightNK细胞。目前NK-92是进入临床研 究的重要细胞系之一,它对不同来源肿瘤的细胞系,如白血病、淋巴瘤、恶性黑 色素瘤、前列腺癌、乳腺癌等都表现出高效的杀伤活性。研究发现NK-92表达 大量的活化受体,如:NKp30、NKp46、2B4、NKG2D、CD28等,而抑制受体 的表达却极少,只有NKGA/B和低水平的KIR2DL4与ILT-2等,几乎完全缺乏 大多数正常NK细胞克隆表达的KIRs,如p58复合体(p58复合体通过结合靶 细胞上的HLA抗原而抑制NK细胞的杀伤),却保留有穿孔素和颗粒酶B介导 的细胞毒作用。它的建立,促进了其在肿瘤过继免疫治疗中的应用,并为深入开 展研究NK细胞的特征、功能、进一步揭示它在免疫系统中的确切作用,提供了 有力的研究材料。

Epstein-Barr Virus(简称为EBV或EB病毒)为疱疹病毒科嗜淋巴细胞属的 成员,在人群中广泛感染,根据血清学调查,我国3~5岁儿童EB病毒VCA-lgG 抗体阳性率达90%以上,幼儿感染后多数无明显症状,或引起轻症咽炎和上呼吸 道感染。青年期发生原发感染,约有50%出现传染性单核细胞增多症。主要通过 唾液传播,也可经输血传染。EB病毒在口咽部上皮细胞内增殖,然后感染B淋 巴细胞,被病毒感染的细胞具有EB病毒的基因组,以环状DNA形式游离在胞 浆或整合于染色体内,这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染。目前EB 病毒临床检测的主流方法为血清学检测,主要检测患者血清中的VCA、EA或EBNA1等抗原,同时也可以结合荧光定量PCR的方法对EB病毒潜伏期表达基 因EBNA进行检测,从而确定患者EB病毒感染情况。EB病毒可长期潜伏在人 体淋巴组织中,当机体免疫功能低下时,潜伏的EB病毒活化形成得复发感染。 研究表明EB病毒主要导致原发性疾病为传染性单核细胞增多症,此外还与多种 人类恶性肿瘤如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌及免疫缺陷患者的B淋巴细胞瘤等多种 癌症的发生密切相关。

大量研究表明,NK-92细胞为EB病毒阳性细胞(Drexler HG,Dirks W, MacLeodRAF,Steube KG,Uphoff CC.Catalogue of Human and Animal Cell Lines. 8thed.DSMZ:Braunschweig,2001.),在基于NK-92为基础的细胞免疫治疗中,病 人存在潜在性致病风险。国内临床相关法规已明确规定用于异体细胞治疗的产品 要进行内外源病毒因子检测,且不得检出包含HIV、HBV、HCV、EBV、HTLV、 CMV等在内的外源性病毒(《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试 行)》,临床研究用人外周血来源NK细胞制剂规范》)。

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