[发明专利]一种农杆菌介导甘蔗生长点遗传转化的方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导甘蔗生长点遗传转化的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1：选定遗传转化的甘蔗材料、菌种和质粒；

步骤2：配制愈伤组织诱导培养基M₁、分化培养基M₂、生根培养基M₃、转化培养基MR和共培养基M₄；

步骤3：对甘蔗愈伤组织的诱导及分化；

步骤4：制备农杆菌工程菌液；

步骤5：使用农杆菌介导对甘蔗生长点进行遗传转化；

步骤6：对转基因植株进行检测；

所述步骤1中甘蔗材料选用桂糖35号，菌种选用大肠杆菌菌株JM109和根癌农杆菌菌株EHA105，质粒选用pCAMBIA3301，质粒中含有CaMV 35s 启动子以及含有编码抗除草剂草丁膦的Bar基因；

所述步骤2中，愈伤组织诱导培养基M₁为 MS + 2,4-D 3.0mg/L + 椰汁100ml/L +蔗糖30g/L + Agar 6g/L，愈伤组织诱导培养基M₁的pH 为5.8，分化培养基M₂为MS + 6-BA2.0mg/L + NAA 0.1 mg/L +椰汁100ml/L + 蔗糖30g/L + Agar 6g/L，分化培养基M₂的pH为5.8，生根培养基M₃为MS + NAA 4.0 mg/L + 椰汁100ml/L + 蔗糖30g/L，生根培养基M₃的pH为5.8，转化培养基MR为1/2MS大量元素 + MS其它成分 + 2,4-D 1.0mg/L + 蔗糖30g/L+ AS 200μmol/L + 葡萄糖10mmol/L + 果糖10mmol/L，转化培养基MR的pH 为5.3，共培养基M₄为MS + 6-BA 2.0mg/L + NAA 0.1 mg/L +椰汁100ml/L + 蔗糖30g/L + Agar 6g/L+AS 100μmol/L，共培养基M₄的pH为5.8，MS大量元素包括硝酸铵（NH₄NO₃）、硝酸钾(KNO₃)、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)和磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，MS其它成分包括微量元素、铁盐和有机物成分，微量元素为碘化钾（KI）、硼酸（H₃BO₃）、硫酸锰（MnSO₄·4H₂O）、硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）、钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）、硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）、氯化钴（CoCl₂·6H₂O）；铁盐：FeSO₄·7H₂O、Na₂-EDTA·2H₂O；有机物成分为肌醇、ⅣB烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸；

所述步骤3的具体过程为，选择田间生长健壮的甘蔗植株尾梢，剥掉叶片，留取28-32cm的尾梢，用75%乙醇消毒表面，剥除4-5层外叶鞘后置于超净工作台内，取其距顶端生长点9-11cm的幼嫩心叶组织作为外植体，横切成0.2 ~ 0.5 mm厚的薄片接种于愈伤组织诱导培养基M₁上，27 ℃暗培养15-20天，外植体膨大，边缘会长出水渍状愈伤组织，把水渍状的愈伤组织分小块接入新的愈伤组织诱导培养基M₁内进行继代增殖培养，15-20天继代一次，直至长出淡黄色、干燥、致密的胚性愈伤组织，其中转接的次数为2-3次，挑取好的胚性愈伤组织，在超净台上剥成大小均一的小颗粒，转接入愈伤组织分化培养基M₂中，光照培养箱内，温度为27 ℃，2000 Lx每天光照16小时，黑暗8小时，诱导出芽，15-20天后转新的愈伤组织分化培养基M₂中壮苗培养；

所述步骤4的具体过程为：将含有pCAMBIA3301质粒的EHA105农杆菌菌株放入-80℃冰箱内保存，从冰箱取出含有pCAMBIA3301质粒的EHA105农杆菌菌株，在含Kan和利福平的YEP板上划线，28℃培养48 h，挑取部分单菌落接种到10ml含Kan和利福平的YEP液体培养基中，温度为28℃，200rpm振荡培养至对数生长期；

取1ml菌液放入50ml含Kan和利福平的YEP液体培养基中，温度为28℃，200rpm振荡培养至OD为0.5-0.6；

将菌液转到离心管中，温度为4℃，5000rpm离心5-8min，弃上清，收集菌体；

将菌体重悬于等体积含200umol/L 乙酰丁香酮的转化培养基MR液体培养基中，温度为28℃，200rpm培养2小时；

所述步骤5的具体过程为：选取在分化培养基M₂上生长旺盛的甘蔗幼苗作为转化材料；

在超净工作台上用镊子分成单株,并用医用剪刀从距离根部1cm剪断，去掉上面带叶子的部分，留取含生长点在内的幼茎，幼茎为1cm的小茎段；

把小茎段转至培养瓶中，加入用200μmol/L AS活化2h的农杆菌液，浸染约5~10min，期间轻微振荡；

5~10min后用镊子取出，用无菌滤纸将菌液吸干后转入无菌水中清洗2-3次，后再用无菌纸吸干，转接到无抗生素的共培养基M₄上，共培养4天；

然后转入含有500mg/L头孢霉素和0.4mg/L PPT的生根培养基M₃中；

经过PPT筛选，将抗性苗转至无抗生素的生根培养基M₃上恢复培养4天；

打开瓶盖移至室外炼苗，2天后将小苗取出，用流水洗净附着的培养基，放在80%空气相对湿度的温室中培养，待苗成活后分单株种植于装有营养土的盘中；

所述步骤6的具体过程为：取生长健壮的转基因植株叶片采用试剂盒提取基因组DNA，将DNA稀释到20 - 40 ng/µl，并以其为模板，用引物3301-F1: CATTTGGAGAGGA CACGCTG；3301-R1: CAAATCTCGGTGACGGGCAG，进行PCR扩增，设立空白水对照组、阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组为质粒pCAMBIA3301， 阴性对照组为未转化的甘蔗GT35基因组DNA；

PCR反应体系为：

Dream Taq Green PCR Master Mix (2X) 10.0 µl

100mmol/L Primer（3301-F1） 1.0 µl

100mmol/L Primer（3301-R1） 1.0 µl

DNA 1.0 µl

ddH20 7.0 µl ；

PCR反应程序为：95 ℃ 5 min， 95 ℃ 50 sec，58 ℃ 30 sec，72 ℃ 1min 35个循环，72 ℃ 5 min，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。