[发明专利]基于宏基因组学的建库方法和检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种基于宏基因组学的建库方法和检测试剂盒，属于感染病原诊断技术领域。该基于宏基因组学的建库方法包括以下步骤：S1：提取待测样本中的基因组核酸；S2：在酶切体系中，使内切酶进行酶切片段化，并以末端修复酶对DNA片段进行末端修复；S3：在S2步骤得到的溶液中加入接头和连接酶，在缓冲液体系中进行接头连接；S4：使用磁珠对连接后的产物进行纯化；S5：对纯化的产物进行扩增；S6：使用磁珠对扩增的产物进行纯化，去除小片段。该建库方法适用于需要对大量样本及多种样本类型的核酸进行宏基因组进行建库的实验室，不仅提高人员和仪器的利用率，降低出错率，还有利于保障建库的成功率，达到24小时极致交付目标。

技术领域

本发明涉及感染病原诊断技术领域，特别是涉及一种基于宏基因组学的建库方法和检测试剂盒。

背景技术

宏基因组(mNGS)技术在发现和转化研究的诸多方面已逐渐成为一种被广泛采用的技术，在急难危重感染性疾病的病原诊断分析中有重要应用，能够对样本中的所有核酸进行无偏向测序，包括人源和微生物的核酸。

体外感染诊断技术可用于全部感染类型的临床样本的检测，如呼吸道感染的痰液、肺泡灌洗液、咽拭子；中枢神经感染的脑脊液；血流感染的血液以及其它样本类型，如胸腹水、组织、石蜡切片等。不同的样本类型中由于宿主细胞及微生物含量的不同，提取的核酸质量波动很大。为了适应多样化的样本建库需求，目前针对宏基因组建库开发的商业试剂盒均针给出了一个较大范围的建库核酸起始投入量，并针对不同的投入量要求使用者对接头进行合适的稀释，以及PCR循环数做适当调整。这对于每天都需要进行大量样本及多种样本类型进行宏基因组构建的医学检验实验室来说，是复杂，耗费人力和PCR仪的流程，需要医学实验室投入更多的人力和物力保障每日的准确，及时的交付工作顺利进行。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种标准化的基于宏基因组学的建库方法和检测试剂盒，该建库方法适用于需要对大量样本及多种样本类型的核酸进行宏基因组进行建库的实验室，不仅可提高人员和仪器的利用率，降低出错率，还有利于保障建库的成功率，达到24小时极致交付目标。

一种基于宏基因组学的建库方法，包括以下步骤：

S1：提取待测样本中的基因组核酸；

S2：在酶切体系中，按照3±2ng基因组核酸：20±5mU内切酶的使用量，使内切酶进行酶切片段化，并以末端修复酶对DNA片段进行末端修复；

S3：在S2步骤得到的溶液中加入接头和连接酶，在缓冲液体系中进行接头连接；

S4：使用磁珠对连接后的产物进行纯化，去除未正确连接、接头短片段和残留的接头；

S5：对纯化的产物进行扩增；

S6：使用磁珠对扩增的产物进行纯化，去除小片段，使文库峰形单一且集中。

本发明人在前期研究中发现，在宏基因组学技术中，由于不同的样本类型中宿主细胞及微生物含量的差异，导致提取的核酸质量波动很大，而本发明人利用自身大数据的样本优势，在对每种样本类型各选取了1000例左右的样本进行核酸提取浓度的总结，发现脑脊液和血液样本的提取浓度较低，有些情况可低于核酸浓度检测仪的检测下线，而痰液和肺泡灌洗液样本的提取浓度可高至100ng/μL，总量约10-20μg，如图1所示。

针对上述现状，本发明对不同类型的样本进行了研究和考察，制定出适合所用样本类型的宏基因组建库方法，将常规技术中需要针对不同类型样本特点，进行个别处理调整的检测方法，统一为标准化处理模式，不仅提高人员和仪器的利用率，降低出错率，还有利于保障建库的成功率。

在其中一个实施例中，所述S1步骤中，采用下述方法提取待测样本中的基因组核酸：

样本裂解：将待测样本加入裂解液中，混合均匀，离心后65℃-70℃孵育10-15min，再次离心后冷却至室温；