[发明专利]基于宏基因组学的建库方法和检测试剂盒

权利要求书

1.一种基于宏基因组学的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：提取待测样本中的基因组核酸；

S2：在酶切体系中，先检测S1步骤得到基因组核酸溶液浓度，再根据所得基因组核酸溶液浓度计算基因组核酸的投料体积，按照3±2ng基因组核酸：20±5mU内切酶的使用量，使内切酶进行酶切片段化，并以末端修复酶对DNA片段进行末端修复；所述内切酶为非限制性内切酶；

S3：在S2步骤得到的溶液中加入接头和连接酶，在缓冲液体系中进行接头连接；

S4：使用磁珠对连接后的产物进行纯化，去除未正确连接、接头短片段和残留的接头；

S5：对纯化的产物进行扩增；

S6：使用磁珠对扩增的产物进行纯化，去除小片段，使文库峰形单一且集中。

2.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的建库方法，其特征在于，所述S2步骤中，末端修复酶为T4 DNA聚合酶或Klenow片段酶，按照3±2ng基因组核酸：1±0.2U末端修复酶的量加入末端修复酶；所述酶切片段化的条件为：37±0.5℃孵育25±2min；所述末端修复的条件为：65±0.5℃孵育30±2min；

所述S3步骤中，按照3±2ng基因组核酸：0.2±0.1ng接头的量加入接头，所述连接酶为T4 DNA连接酶，所述接头连接的反应条件为：20±0.5℃下保持15±1min。

3.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的建库方法，其特征在于，所述S3步骤中，所述缓冲液体系中还包括体积百分浓度为30％-35％的PEG8000和质量百分浓度为0.0001±0.00002％的羟丙基甲基纤维素。

4.根据权利要求1-3任一项所述的基于宏基因组学的建库方法，其特征在于，还包括S7步骤，对文库所得产物进行单链环化和纳米球制备，具体方法为：

按每个文库需要产生的数据量计算每个文库的投入质量，混合预定文库；将混合后文库与短接头进行热变性，变性后置于冰上备用；将变性后的文库加入到单链环化反应体系环化反应；对环化的产物进行未环化文库的消化，使用RNA磁珠进行纯化；对纯化的产物进行引物杂交和滚环扩增，即可获得纳米球。

5.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的建库方法，其特征在于，所述待测样本为脑脊液、血液、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水或尿液。

6.权利要求1-5任一项所述的基于宏基因组学的建库方法得到的宏基因组文库。

7.一种非诊断用途的病原检测方法，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的基于宏基因组学的建库方法，还包括以下步骤：

测序：对构建得到的文库进行测序；

生信分析：以生物信息学分析方法去除宿主序列，获得病原基因信息。

8.一种基于宏基因组学的检测试剂盒，其特征在于，包括：

酶切及末端修复试剂：包括内切酶和末端修复酶，所述内切酶的工作用量为20±5mU，所述末端修复酶的工作用量为1±0.2U；

接头及连接试剂：包括接头、连接酶和连接缓冲液，所述接头的工作用量为0.2±0.1ng，所述连接酶为T4 DNA连接酶；所述连接缓冲液包括：体积百分浓度为30％-35％的PEG8000和质量百分浓度为0.0001±0.00002％的羟丙基甲基纤维素；

扩增试剂：包括PCR扩增酶，扩增缓冲液以及扩增引物；

纯化试剂：包括PEG缓冲液磁珠。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述纯化试剂包括0.6×PEG缓冲液磁珠和0.9×PEG缓冲液磁珠。