[发明专利]一种无乳链球菌扩增引物组和应用及无乳链球菌的检测方法

说明书

本发明涉及一种无乳链球菌扩增引物组和应用及无乳链球菌的检测方法，属于微生物检测技术领域。无乳链球菌的检测方法，包括以下步骤：1)设计特异基因groEL的MCDA扩增引物组：CP1、CP2、F1、F2、D1*、D2、C1、C2、R1*以及R2；2)在包括所述扩增引物组的反应体系下，以待测无乳链球菌样品的基因组作为模板进行MCDA恒温扩增，得到扩增产物；3)使用金纳米生物传感器检测步骤2)的扩增产物，获得检测结果。本发明方法以多交叉恒温扩增为基础，结合纳米生物检测技术，能够直接从临床样本中快捷、敏感、高特异性的检测及鉴定无乳链球菌。

【技术领域】

本发明涉及微生物学和分子生物学技术领域，具体涉及一种无乳链球菌扩增引物组和应用及无乳链球菌的检测方法。

【背景技术】

无乳链球菌(S.agalactiae)是一种β溶血的革兰氏阳性细菌。该病原体可定植于妊娠期妇女的阴道、肠道和尿道，引起孕妇发生尿道感染，菌血症，绒毛膜羊膜炎和胎盘早剥，可能会进一步诱发胎儿早产和死胎，也可导致新生儿肺炎，脓毒症和脑膜炎。因此，产前筛查和早期诊断孕妇无乳链球菌有助于预防婴儿严重疾病的发生。

目前对于无乳链球菌的检测主要依赖于传统的分离培养和生化鉴定。该方法耗时较长(2至7天)，包括二次增菌，选择培养及后续的生化鉴定，尽管生化鉴定可依靠全自动微生物鉴定仪进行结果判读，但该方法仍存在耗时耗力的缺点。随着分子诊断技术的快速发展，一些基于富集培养的PCR诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于无乳链球菌的筛查，然而这些方法需要昂贵的热循环仪器设备和昂贵的探针合成，后续的电泳操作，及熟练的操作人员。然而一些基层医院和现场检测无法满足上述条件，限制了这些技术的运用。尽管富集培养联合PCR技术和荧光PCR技术增加了检测的灵敏度，但是检测周期仍较长，并不能满足早产或者即将生产孕妇的需求。因此，为了给予产妇准确快速的诊断，研发一个省时、省力和特异性较高的检测方法，能够同时检测和鉴定无乳链球菌成为必要。

为了克服基于PCR扩增技术的劣势，许多恒温扩增技术应运而生。相较于PCR技术而言，恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，简单，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。目前，应用较为广泛的恒温技术包括滚环扩增(RCA)、连置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温技术存在多种酶同时工作，试剂昂贵，操作步骤复杂等缺陷，并且这些方法的实用性，便捷性，可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域及资源有限地区。

中国专利公开文件CN106399517A针对志贺菌的特异基因ipaH和沙门菌的特异基因invA分别设计MCDA扩增引物，将MCDA技术与纳米生物检测技术(LFB)相结合，实现了对两种菌种的检测；中国专利公开文件CN108220398A。针对肺炎克雷伯菌特异基因rcsA设计MCDA扩增引物，并结合纳米生物检测技术，实现了肺炎克雷伯菌的特异性检测。

目前，尚未有针对无乳链球菌的特异性基因设计MCDA扩增引物，并结合LFB技术展开特异性检测的研究。因此，有必要结合MCDA-LFB研究无乳链球菌的特异性检测的可行性，进一步设计特异性引物，进而提供更灵敏、更客观、更易于携带、更简单的检测方法。

【发明内容】

针对现有技术的不足，本发明提供了基于无乳链球菌的特异性基因设计MCDA扩增引物组，并结合LFB技术实现无乳链球菌的特异性高效检测。

为解决上述问题，本发明提供了一种无乳链球菌扩增引物组，包括：

如SEQ ID NO：1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO：2所示的置换引物F2，如SEQ IDNO：3所示的交叉内引物CP1，如SEQ ID NO：4所示的交叉内引物CP2，以及如SEQ ID NO：5-10所示的扩增引物C1、C2、D1、D2、R1和R2；其中，所述扩增引物D1的5’端标记荧光素，得到D1*；所述扩增引物R1的5’端标记生物素，得到R1*。