[发明专利]一种NK细胞扩增组合物及体外扩增培养方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，公开了一种NK细胞扩增组合物及体外扩增培养方法本发明通过分离获取外周血单个核细胞，在体外经过含高浓度IL‑2的A组培养液预处理和经过含有CD3、CD52单抗的B组培养液激活后，再使用C组培养液进行自然杀伤细胞体外扩增，最终制备获得足量且高纯度的自然杀伤细胞。使用本发明的方法扩增的NK细胞，在体外可以有效杀伤K562细胞，杀伤效率超过80％，NK细胞扩增倍数高达550倍。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种NK细胞扩增组合物及NK细胞体外扩增培养方法。

背景技术

2000年国际肿瘤生物治疗及基因治疗年会中指出“免疫细胞疗法是现代科技中唯一有可能彻底治愈癌症的方法”。经过几十年研究，免疫细胞治疗已经取得了突飞猛进的发展。目前嵌合抗原受体-T(Chimeric Antigen Receptor-T,CAR-T)细胞免疫疗法在血液系统肿瘤治疗中展现出非常良好的应用前景，全球已有两款CAR-T细胞产品上市，但CAR-T细胞免疫疗法对于实体瘤的应用尚未取得突破性进展。

自然杀伤(Natural Killer,NK)细胞同属于免疫细胞的一种，对于人体内的癌细胞、衰老细胞以及被病毒感染细胞均有非常强的杀伤清除作用。NK细胞发挥杀伤作用主要有四种途径，第一：释放细胞质颗粒(如穿孔素和颗粒酶)，第二：死亡受体(FasL,TRAIL,TNF-α)诱导凋亡，第三：产生效应分子(IFN-γ,NO)，招募其他类型免疫细胞参与杀伤作用，第四：抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody dependent cell-mediatedcytotoxicity,ADCC)。

癌症患者的免疫功能降低主要表现在体内NK细胞活性的降低和NK细胞的减少，不足以对体内的癌细胞产生杀伤效果，因此采用体外激活NK细胞并大量扩增的方法来重构NK细胞的抗肿瘤能力，得到了广泛的关注。当前已经有非常多的关于NK细胞治疗各类癌症的临床研究，但最终的结果却不尽如人意。主要表现在两个方面，第一：NK细胞临床级数量扩增问题，即如何能在短时间内获得足量的NK细胞数量；第二：NK细胞质量问题，即NK细胞在体外经过培养扩增后的杀伤效率能否得到有效的提升。虽然目前开发了以肿瘤细胞K562为滋养层细胞进行NK细胞的体外扩增方法，且可以获得纯度较高的临床级细胞，但该方法获得的细胞的安全性问题始终无法确切知晓，所以我们需要一种能够有效提高NK细胞体外扩增的数量和质量的细胞制备方法。

发明内容

为了克服现有技术中安全性问题，NK细胞数量及质量问题，本发明提供一种NK细胞扩增组合物及体外扩增培养方法。

本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种NK细胞扩增组合物，包括：

A组：T细胞培养液，IL-2；

B组：CD3单抗溶液，CD52单抗溶液；

C组：T细胞培养液，IL-2，IL-15，自体灭活血浆。

作为优选的实施方式，A组中，IL-2的浓度为1000IU/mL～4000IU/mL。

作为优选的实施方式，CD3单抗溶液和CD52单抗溶液的浓度分别独立地为5μg/mL～20μg/mL。

作为优选的实施方式，C组中，IL-2的浓度为200IU/mL～2000IU/mL，IL-15的浓度为2ng/mL～30ng/mL。

本发明还提供了一种NK细胞体外扩增方法，包括以下步骤：

(1)提取外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞加入到A组培养液中培养，所述A组培养液为T细胞培养液+1000IU/mL～4000IU/mL IL-2。