[发明专利]具有启动子活性的多核苷酸及其在生产氨基酸中的应用

说明书

本公开涉及具有启动子活性的多核苷酸及其在生产氨基酸中的应用。具体来说，本公开涉及具有启动子活性的多核苷酸，含有前述多核苷酸的转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及增强目标基因表达的方法、制备蛋白的方法和生产氨基酸的方法。本公开具有启动子活性的多核苷酸是SEQ ID NO：9所示序列的多核苷酸的突变体，与SEQ ID NO：9所示序列的多核苷酸相比，突变体的启动子活性显著增强，能够促使目标基因稳定高效表达，进而稳定、高效的生产下游产物。

技术领域

本公开属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种具有启动子活性的多核苷酸，包含具有启动子活性的多核苷酸的转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及增强目标基因表达的方法、制备蛋白的方法和生产氨基酸的方法。

背景技术

赖氨酸(lysine)的化学名称是2,6-二氨基庚二酸，是动物和人体必需氨基酸，能促进人体发育、增强免疫能力，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸有L-型(左旋)、D-型(右旋)和DL型(消旋型)三种化学旋光异构体，其中只有L型才能为生物所利用，通常所说的赖氨酸即为L-赖氨酸。

L-赖氨酸是常见的组成蛋白质的20种氨基酸之一，与组氨酸和精氨酸同属于碱性氨基酸。由于人体和动物体不能靠自身合成L-赖氨酸，只能从食物中获取，属于八大必须氨基酸之一。L-赖氨酸在人类主食谷物食品中的含量较低，缺乏会引起蛋白质代谢及功能障碍，对生长造成不利影响，并且在加工过程中容易被破坏，故被称为第一限制性氨基酸，在医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中有着十分重要的地位。

目前为止，工业上生产L-赖氨酸的方法主要有三种：蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法。其中微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业生产L-赖氨酸应用最广泛的方法。棒状细菌和埃希氏菌在L-赖氨酸的工业化生产中获得了广泛应用，常用的埃希氏菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，常用的棒状细菌有棒状杆菌属的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，短杆菌属的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentus)，以及节杆菌属的某些种和微杆菌属的某些种。

在已知的具有L-赖氨酸生物合成途径的微生物和植物中，可以将L-赖氨酸生物合成途径划分为两个完全不同的途径，即氨基乙二酸途径(AAA)和二氨基庚二酸途径(DAP)。二氨基庚二酸途径(DAP)是天冬氨酸族氨基酸合成途径中的一部分，以天冬氨酸为底物，DAP途径存在合成内消旋二氨基庚二酸的琥珀酰化酶途径、乙酰酶途径和转氨酶途径，以及不经过内消旋二氨基庚二酸直接合成外消旋二氨基庚二酸的脱氢酶途径。

谷氨酸棒杆菌是一种重要的工业微生物，其优势在于能发酵生产工业化规模的氨基酸。谷氨酸棒杆菌利用脱氢酶途径合成L-赖氨酸有6个酶催化反应，分别是天冬氨酸激酶(AK，由基因lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(ASADH，由基因asd编码)、二氢吡啶二羧酸合酶(DHDPS，由基因dapA编码)、二氢吡啶二羧酸还原酶(DHDPR，由基因dapB编码)、二氨基庚二酸脱氢酶(DAPDH，由基因ddh编码)和二氨基庚二酸脱羧酶(DAPDC，由基因lysA编码)。谷氨酸棒杆菌利用琥珀酰化酶途径合成L-赖氨酸的过程中还涉及合成内消旋二氨基庚二酸的四种酶：琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶(由基因dapD编码)，四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶(由基因dapC编码)，琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶(由基因dapE编码)及二氨基庚二酸差向异构酶(由基因dapF编码)。众所周知，增强L-赖氨酸合成途径中的一个或多个基因的表达，能够有效提高L-赖氨酸的产量。