[发明专利]一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法

说明书

本发明公开了一种β‑烟酰胺单核苷酸的制备方法。所述制备方法利用氨基酸序列如NCBI登录号XP_013025941.1、XP_013017940.1、XP_023459718.1、TVY65083.1、KAF4999805.1、XP_024756901.1、XP_018180784.1和/或PMB71451.1所示的烟酰胺核糖核苷激酶，在存在磷酸供体的体系中将烟酰胺核糖和/或烟酰胺核糖氯化物进行磷酸化反应，得到所述β‑烟酰胺单核苷酸。本发明所述的β‑烟酰胺单核苷酸制备方法实现了提高底物浓度的同时维持高转化率、催化时间大幅缩短的效果，有利于以烟酰胺核糖为原料大规模生产β‑烟酰胺单核苷酸并降低生产成本。

技术领域

本发明涉及生物催化领域，具体涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononuclotide，β-NMN或NMN)是NAD⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又称辅酶1)最直接的前体，NAD⁺是参与细胞新陈代谢、氧化还原、蛋白质转录等上千种重要生理反应的重要活性物。由于NAD⁺分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD⁺前体小分子物质β-NMN的研究发现，食用β-NMN可以有效提升体内NAD⁺的含量，并显著抑制机体衰老，使得β-NMN成为了“不老神药”，在功能性保健食品方面有着很大的开发潜力和市场前景。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成份开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarbor NMN9000、日本MIRAI LAB NMN3000胶囊、澳大利亚synext等。

生物酶法制备NMN的一条路线是以D-核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到NMN。该条路线中间产物较多，后续分离纯化较困难，因而总体收率偏低，导致生产成本高。

生物酶法制备NMN的另一条路线是以D-5-磷酸核糖和烟酰胺为原料，在ATP存在下，在磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPPs)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)的催化下，制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，如CN2018109407295公开了这种方法，底物的转化率可达86.9％-89.8％。又如WO2018/023206公开了以烟酰胺和5'-磷酸核糖基-1'-焦磷酸(PRPP)为原料，烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体(F180A)的催化作用下制备NMN，底物烟酰胺转化率可达66％。

另一条路线是以烟酰胺核糖(NR)为起始原料，在烟酰胺核糖核苷激酶(Nicotinamide Ribonucleoside kinase，NrK)和ATP的作用下，一步反应得到NMN，收率高，产品纯度高。其中专利CN2016112456194，以烟酰胺核糖(NR)为底物，在ATP等磷酸供体存在下，在来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的烟酰胺核糖激酶的催化下反应24h生成β-烟酰胺单核苷酸，高效液相色谱检测烟酰胺核糖转化率为90％以上，纯化后β-烟酰胺单核苷酸纯度大于95％，但是底物烟酰胺浓度仅为18mM。专利CN2019107231777公开了一种来源于马克斯克鲁维酵母的烟酰胺核糖核苷激酶NrK及其突变体(D45E/D58Q/R161K/Y164W)基因，并提供该酶体外异源表达体系的构建方法和酶突变体的构建方法，以及该酶及其突变体作为生物催化剂用于催化NR制备烟酰胺单核苷酸的方法。反应20h后HPLC检测底物NR转化率80％，纯化后得到β-烟酰胺单核苷酸纯度大于98％，底物烟酰胺浓度最高为50g/L，但随着其底物浓度从10g/L增加至50g/L，转化率从90％降低至80％。

但是现有技术中，这些方法的转化率，以及底物投料浓度都还有待提高；并且反应时间过长，不利于大规模生产应用。

发明内容