[发明专利]一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法

权利要求书

1.一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其包括使用烟酰胺核糖核苷激酶和磷酸供体，将烟酰胺核糖和/或烟酰胺核糖氯化物进行磷酸化反应，得到所述β-烟酰胺单核苷酸，其特征在于，所述烟酰胺核糖核苷激酶为氨基酸序列如NCBI登录号XP_013025941.1、XP_013017940.1、XP_023459718.1、TVY65083.1、KAF4999805.1、XP_024756901.1、XP_018180784.1和/或PMB71451.1所示的烟酰胺核糖核苷激酶；优选地，编码所述烟酰胺核糖核苷激酶的核苷酸序列为如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述烟酰胺核糖和/或烟酰胺核糖氯化物的浓度为5g/L～150g/L；优选地，所述烟酰胺核糖氯化物的浓度为100g/L。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的磷酸供体为ATP或ATP钠盐；所述磷酸供体与所述烟酰胺核糖和/或烟酰胺核糖氯化物的质量比为1:1000～3:1；优选地，所述ATP钠盐与烟酰胺核糖氯化物的质量比为5:2。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述烟酰胺核糖核苷激酶与所述烟酰胺核糖和/或烟酰胺核糖氯化物的质量比为1:2000～1:60；优选地，所述烟酰胺核糖核苷激酶与所述烟酰胺核糖氯化物的质量比为1:350。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸化反应温度为20～40℃；优选地，所述磷酸化反应的温度为25℃；

和/或，所述磷酸化反应pH值为6～8；优选地，所述磷酸化反应的pH为7.0。

6.如权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括磷酸供体再生的步骤：利用磷酸转移酶和磷酸原料将失去磷酸基团的磷酸供体产物进行磷酸化为磷酸供体；在包括磷酸供体再生的步骤时，所述磷酸供体与烟酰胺核糖氯化物的质量比优选为1:10；

优选地，所述磷酸转移酶为乙酸激酶，所述失去磷酸基团的磷酸供体产物为ADP或ADP钠盐；和/或，所述磷酸原料为磷酸化合物；更优选地，所述磷酸化合物为乙酰磷酸盐，包括乙酰磷酸二钠、乙酰磷酸二钾和/或乙酰磷酸二铵；

进一步更优选地，所述烟酰胺核糖核苷激酶或所述磷酸转移酶的制备包括以下步骤：

(1)将含有所述烟酰胺核糖核苷激酶或所述磷酸转移酶的工程菌培养至OD600为0.5～1.0，优选0.8，所述工程菌优选为E.coliBL21(DE3)，25℃诱导优选用终浓度为0.1mM的IPTG诱导并培养12～24小时，优选16小时；

(2)收集菌体并以1:5～1:10的重量体积比重悬至缓冲液，破碎后得到粗酶液，所述重量体积比的单位为g/mL；优选地，所述粗酶液经纯化，例如用Ni BestaroseHP树脂纯化，和/或，所述缓冲液为50mM pH 7.5的磷酸钠或Tris-HCl缓冲液。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸激酶的氨基酸序列如NCBI登录号AAC75356.1所示；

优选地，所述乙酸激酶与所述乙酰磷酸盐的质量比为1:300～1:20；

更优选地，所述乙酰磷酸盐为乙酰磷酸二钠，所述乙酸激酶和乙酰磷酸二钠的质量比为1:86；和/或，编码所述乙酸激酶的核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

8.如权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，磷酸供体再生的步骤的反应温度为20～40℃；优选地，磷酸供体再生的步骤的反应温度为25℃；

和/或，磷酸供体再生的步骤的反应pH值为6～8；优选地，磷酸供体再生的步骤的反应pH为7.0。