[发明专利]一种银杏达莫注射制剂的检测方法

权利要求书

1.一种银杏达莫注射制剂的检测方法，所述银杏达莫注射制剂是由银杏叶提取物和双嘧达莫制备而成的注射液，其特征在于：检测方法如下：

性状：

注射液为黄色至棕黄色澄明液体；

鉴别：

（1）取注射液2 ml，加镁粉少许，加浓盐酸数滴，放置后渐显红色；

（2）取注射液2 ml，加乙醇10 ml，即显绿色荧光，加稀盐酸后荧光消失；

（3）在双嘧达莫、总黄酮醇苷、萜类内酯含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的保留时间应与相应对照品峰和银杏总内酯对照提取物峰的保留时间一致；

（4）取注射液50ml，通过D101型大孔吸附树脂柱，用水250ml洗脱，弃去水洗液，再用乙醇250ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加正丁醇15ml，置水浴中温浸15分钟并时时振摇，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取银杏叶对照提取物0.2g，加正丁醇15ml，同法制成对照提取物溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1µl，分别点于同一含4％醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯：丁酮：甲酸：水＝5：3：1：1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液；置365nm波长的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照提取物色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：

pH值 照中国药典pH值测定法检查，pH值为3.5～5.5；

黄酮苷元峰面积比 按总黄酮醇苷含量测定项下色谱计算，槲皮素与山柰素的峰面积比值应为0.8～1.2，异鼠李素与槲皮素的峰面积比值应大于0.15；

炽灼残渣 精密量取注射液10ml，蒸干，照中国药典炽灼残渣检查法检查，每1ml不得过1.0mg；

总固体 精密量取注射液10ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，精密加入经105℃干燥至恒重的硅藻土3g，搅拌，置105℃干燥3小时，移置干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，扣除加入的硅藻土量，计算，每1ml注射液含总固体应为0.2～0.3g；

5-羟甲基糠醛 照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇：0.4%冰醋酸＝4：96为流动相，流速每分种1.0ml，柱温30℃，检测波长为284nm；理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算应不低于4000；

对照品溶液的制备 取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含 50μg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备 取注射液，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；计算5-羟甲基糠醛含量；

总银杏酸 照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含0.1%三氟乙酸的乙腈为流动相A，含0.1%三氟乙酸的水为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为310nm，理论板数按白果新酸峰计算应不低于4000；所述梯度洗脱条件为：

0-30min，流动相A 75→90%，流动相B 25→10%；

30-35min，流动相A 90%，流动相B 10%；

25-35min，流动相A 17%，流动相B 83%；

35-36min，流动相A 90→75%，流动相B 10→25%；

36-45min，流动相A 75%，流动相B 25%；

对照品溶液的制备 取白果新酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含1μg的溶液，作为对照品溶液，另取总银杏酸对照品适量，用甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为定位用对照溶液，

供试品溶液的制备 取注射液，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

测定法 分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积，以白果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量；

重金属及有害元素残留量 照中国药典铅、镉、砷、汞、铜测定法测定，每1ml注射液含铅不得过0.24μg，含镉不得过0.06μg，含砷不得过0.12μg，含汞不得过0.04μg，含铜不得过3.00μg；

蛋白质 照中国药典注射液有关物质检查法测定，取本品1ml，加新配制的30%磺基水杨酸溶液lml，混匀，放置5分钟，不得出现浑浊，注射液中如有酸产生沉淀的成分，改加鞣酸试液1〜3滴，不得出现浑浊；

鞣质照中国药典注射液有关物质检查法测定，取本品1ml，加新配制的含1%鸡蛋清的生理氯化钠溶液5ml ，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀，如出现浑浊或沉淀，取注射液lml，加稀醋酸1滴，再加氯化钠明胶试液4〜5滴，不得出现浑浊或沉淀；

草酸盐照中国药典注射液有关物质检查法测定，取本品5ml，用稀盐酸调节pH值至1〜2, 滤过，取滤液2ml，滤液调节pH值至5〜6，加3%氯化钙溶液2〜3滴，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀；

树脂 照中国药典注射液有关物质检查法测定，取本品5ml，加盐酸1滴，放置30分钟，不得出现沉淀，如出现沉淀，另取本品5ml， 加三氯甲烷10ml振摇提取，分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞试管中，加水3ml，混匀，放置30分钟，不得出现沉淀；

钾离子照中国药典注射液有关物质检查法测定，取本品2ml，蒸干，先用小火炽灼至炭化 ，再在500〜600℃炽灼至完全灰化，加稀醋酸2 ml溶解，置 25ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，作为供试品溶液，取10ml纳氏比色管两支，甲管中精密加入标准钾离子溶液0.8ml，加碱性甲醛溶液0.6ml、3%乙二 胺四 醋酸二钠溶液2滴、3%四苯硼钠溶液0.5ml，加水稀释成10ml，乙管中精密加入供 试品溶液lml，与甲管同时依法操作，摇匀，甲、乙两管同置黑纸上，自上向下透视，乙管中显出的浊度与甲管比较，不得更浓；所述碱性甲醛溶液是取甲醛溶液，用0.1mol/L 氢氧化钠溶液调节pH值至8. 0〜9. 0；

热原 取注射液用10 %葡萄糖注射液稀释一倍，照中国药典热原检查法检查，剂量按家兔体重1 kg缓缓注射稀释液3 ml，应符合规定；

其他应符合中国药典注射剂项下有关规定；

指纹图谱：照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.4%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为254nm；理论板数按芦丁峰计算应不低于10000；

所述梯度洗脱条件为：

0-5min，流动相A 8→12%，流动相B 92→88%；

5-25min，流动相A 12→17%，流动相B 88→83%；

25-35min，流动相A 17%，流动相B 83%；

35-45min，流动相A 17→23%，流动相B 83→77%；

45-60min，流动相A 23→25%，流动相B 77→75%；

60-75min，流动相A 25→60%，流动相B 75→40%；

参照物溶液的制备 取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备 取注射液，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录75分钟的色谱图，即得供试品指纹图谱；

供试品指纹图谱中，应呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，应有15个共有峰，其中4号峰为喋豆素峰，6号峰为芦丁峰，9号峰为槲皮素3-O-葡萄糖基（1→2）鼠李糖苷峰，10号峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰，11号峰为水仙苷峰，13号峰为3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素峰，14号峰为3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚峰，15号峰为双嘧达莫峰；共有峰匹配，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90；

含量测定：

（1）双嘧达莫 照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1%磷酸二氢钠溶液：甲醇＝25：75为流动相，所述0.1%磷酸二氢钠溶液预先用1→3的磷酸溶液调pH值至4.6；流速为每分钟1.0 ml；检测波长为290 nm；理论板数按双嘧达莫峰计算应不低于2000；

对照品溶液制备 取双嘧达莫对照品适量，精密称定，加80%甲醇溶液制成每1 ml中含15μg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液制备 精密量取注射液2 ml，置50 ml量瓶中，加80 %甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，取续滤液，即得供试品溶液；

测定法 分别精密量取对照品溶液及供试品溶液20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算双嘧达莫含量；

（2）总黄酮醇苷 照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：0.4%磷酸溶液＝50：50为流动相；检测波长360nm；理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于2500；

对照品溶液的制备 取槲皮素对照品、山柰素对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含槲皮素0.03mg、山柰素 0.025mg和异鼠李素 0.01mg的混合溶液，摇匀，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备 精密量取注射液10ml，加甲醇： 33%盐酸溶液＝6：1的混合溶液35ml，置水浴上加热回流60分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按下式计算总黄酮醇苷含量：

总黄酮醇苷含量=（槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量）×2.51；

（3）芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.4%磷酸溶液=16：84为流动相；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长360nm；理论塔板数按芦丁峰计算应不低于5000；

对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品、山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品、水仙苷对照品适量，加80%甲醇制成每1ml含芦丁0.08mg、山柰酚-3-O-芸香糖苷0.07mg和水仙苷0.06mg的混合溶液，摇匀，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备 取注射液，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，分别计算芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷含量；

（4） 萜类内酯 照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以正丙醇：四氢呋喃：水＝1:15:84为流动相；用蒸发光散射检测器检测；理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500；

对照提取物溶液的制备 取银杏叶总内酯对照提取物适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含2.5mg的溶液，即得对照提取物溶液；

供试品溶液的制备 精密量取注射液20ml，加2％盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇提取5次，第1次20ml，其余4次每次15ml，合并乙酸乙酯提取液，用5％醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，再用乙酸乙酯10ml洗涤；合并乙酸乙酯提取液及洗涤液，用水洗涤2次，每次20ml，分取水液，用乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

测定法 分别精密吸取对照提取物溶液3μl、10μl，供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量。

2.据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检查项目中：所述5-羟甲基糠醛限量为：每1ml注射液中含5-羟甲基糠醛不得过0.01mg；所述总银杏酸限量为：每1ml注射液中含总银杏酸不得过15ng；含量测定项目中：每1ml注射液含双嘧达莫应为0.36～0.44 mg；每1ml注射液含总黄酮醇苷应为0.85～1.10mg；每1ml注射液含芦丁应为0.06mg~0.12mg，含山柰酚-3-O-芸香糖苷应为0.05mg~0.10mg，含水仙苷应为0.04mg~0.08mg；每1ml注射液含萜类内酯以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C总量计不得少于0.18mg。