[发明专利]一种用于待测样品间麦角硫因含量高低的高通量检测方法及其应用

说明书

本发明公开一种用于待测样品间麦角硫因含量高低的高通量检测方法及其应用，属于微生物育种的技术领域。本发明将待测样品调节pH 1.9～2.0，先加入硫氰酸铁溶液于酶标板中，再加入待测样品，吹打混合；使用酶标仪记录吸光度，酶标仪所用波长为450nm～470nm；吸光度越低，麦角硫因含量越高。该方法具有高效、快速，方便，成本低的特点，适用于不需要准确测定每一种样品的麦角硫因含量的研究活动；克服了使用LC‑MS检测方法耗时、成本高的缺陷。

技术领域

本发明属于微生物育种的技术领域，具体涉及到一种用于待测样品间麦角硫因(EGT)含量高低的高通量检测方法及其在灵芝(Ganoderma)测定中的应用。

背景技术

麦角硫因(ergothioneine，EGT)又名为2-硫基-L-组氨酸三甲基内盐，是存在于很多动植物体内含量丰富的天然氨基酸(李轶群和周念波2010)，仅在部分微生物(放线菌、链霉菌)、蕈菌、某些蓝细菌中合成，不能由动物机体自身合成EGT，只能从食物中摄入并吸收积累在组织和细胞中(潘虹余等2019)。EGT被认为是一种很强的抗氧化剂，Servillo等对其抗氧化机理进行了探讨，认为其拥有独特的氧化还原机制，并提出了一种EGT在细胞中的独特抗氧化作用(Servillo等.2015)。EGT在溶液中以硫醇和硫酮互变异构状态存在，在生理pH值下，硫羰基的稳定性高于巯基，因此EGT主要是以硫酮形式存在(Cumming等.2018)。EGT的标准氧化还原电位是-0.06V，其它硫醇的电势一般在-0.2～-0.32V之间，因此EGT在生理pH环境下比其他抗氧化剂更稳定，不易自发氧化(刘琦等.2015)。EGT可以有效清除氢氧根离子、抑制铜离子依赖型的氧合血红蛋白的氧化，还能强有力地清除次氯酸，从而能阻止α₁-抗蛋白酶失活(林陈水等.2006)。EGT还能够保护细胞，尤其是机体红细胞免于自由基的损伤。EGT在医药、食品和化妆品等行业具有广泛的应用前景。

近年来人们逐渐深入对抗氧化剂的研究，EGT作为一种强抗氧化能力的天然活性物质受到人们广泛的关注，目前国内对EGT的研究还处于探索阶段，在国外已有较多人对EGT的合成途径和生物活性进行探讨和研究。EGT是次生代谢产物，其制备方法主要有3种：化学合成法、生物提取法、生物合成法。对于化学合成法，EGT是一种手性氨基酸，要合成左旋的EGT很困难，多种合成方法因局部或全部外消旋而没有达到预期效果。虽然现在美国一家公司研制出商业化合成EGT的方法，但原料昂贵、合成成本高。生物提取法获得也有较大问题，在自然界，EGT广泛存在于生物体中，Carolin等发现蓝藻可以产生出高水平的EGT(Pfeiffer等.2011)，但仍不能满足研究和生产需求。大多数生物原料中EGT含量普遍较低，有提取后杂质较多，提取操作复杂、成本高等缺点。为了克服自然界生物EGT产量普遍偏低的不足，Tanka等将分枝杆菌中的egtBCDE基因转入大肠杆菌中并使用发酵罐进行发酵生产(Tanaka等，2019)，该方法虽然可得到大量的EGT，但其安全性受到了质疑。

食用菌子实体和菌丝体内普遍含有EGT，此外，食用菌中含有多种生物活性因子，如多萜类物质、多糖、功能性蛋白、黄酮、多酚等，对人体有各类保健功能，如提高免疫调节能力、预防癌细胞形成、抗衰老等(张云野等，2016)。根据统计中国食用菌有936种、23变种、3亚种和4变型(戴玉成等，2010)，利用食用菌深层发酵制备EGT，具有生产成本低、可通过代谢调控等技术手段提高产物的产量，易于规模化生产等优势，更能够保证产品的安全性(梅保良等，2015)。在EGT含量的检测方面，Lee等利用液相色谱(LC-MS)检测对28种蘑菇EGT进行了比较(Lee等.2009)，张翠等也同样使用LC-MS检测方法检测了10种不同蘑菇中EGT含量，其中榛蘑伞和金针菇含量较高，而白蘑伞和平菇中含量较低(张翠等2013)。根据研究，不同品种的食用菌中，EGT含量差异较大。