[发明专利]一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法

说明书

本发明提供了一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，包括如下步骤：(1)构建靶向拟敲除质粒的整合自杀载体(2)整合自杀载体的筛选与转化(3)细菌的第一轮筛选(4)细菌的第二轮筛选。本发明所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法不影响细菌本身基因组的稳定性，方法在多种菌种中得到验证，且24kbp至340kbp大小的质粒都能做到质粒的高效敲除，方法简单有效，清除率高达100％。

技术领域

本发明属于基因编辑领域，尤其是涉及一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法。

背景技术

质粒广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。细菌中含有的质粒为独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。质粒对宿主生存并不是必需的，但是，质粒往往为宿主提供了环境抗性。质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属的抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。

对质粒进行遗传学与功能研究时，常希望得到其消除质粒的衍生菌株，这样可以方便比较观察质粒的遗传功能，同时完全消除质粒的菌株还可以用于基因工程菌，这在分子生物学研究领域被广泛应用。质粒的消除可以减弱细菌的毒性，还可应用于细菌疫苗的研究与开发。质粒在工程菌种中有时是无用的，增加了细菌的代谢副产物，因此，质粒的消除还可在生物工程领域减少副产物的产生，降低产物纯化成本。

质粒可自发的从细胞中丢失，但是自然丢失的概率很低，仅为10^-2-10^-8，另外，质粒丢失菌的生长速度与野生菌一般差异不大，这决定了很难将自然丢失质粒的细菌筛选出来。目前多采用物理或化学方法干扰质粒复制，人为地提高质粒丢失的频率，以达到质粒消除的目的。已经报道的质粒清除案例：1.Leavitt等使用比最适温度高5℃培养Klebsiellapneumoniae菌株，消除了其内源质粒；2.Heery等用高压电穿孔法消除了Escherichia coliDH1的内源质粒puG2；3.Spengler等研究了吩噻嗪及其衍生物对Escherichia coli K12的质粒消除作用；4.Mathem等利用EB成功消除了肠杆菌(Enterobacter)内源质粒；5.文良柱等使用SDS提高培养温度相结合的方法，有效地消除大肠杆菌中的抗生素抗性质粒。

物理或化学方法消除质粒存在清除效率低，效果不稳定，化学试剂毒性较大，以及可能对基因组造成不可预料的突变。因此，分子生物学手段消除质粒的方法更有优势。

分子生物学手段消除质粒的方法包括：1.利用质粒的不相容性原理，将亲缘关系密切的质粒转化到细胞内，由于亲缘相近的质粒不能稳定共存于同一个宿主菌中，使得细胞在增值过程中将其中一个质粒丢失，也可达到消除目标质粒的目的。2.郝明巨等报道的CRISPR/Cas9酶切蛋白特异性切除的手段去除质粒。

但是，质粒在细菌内部往往是多拷贝，CRISPR/Cas9酶切很难将每个质粒都切除，而且细菌本身含有DNA连接酶，会将切断的质粒重新连接，不能保证质粒的消除效率。质粒的不相容性方法需要精准克隆复制起点，且对于含有多个复制起点的大型质粒往往无效。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，包括如下步骤：

(1)构建靶向拟敲除质粒的整合自杀载体：扩增拟清除质粒的特异性DNA片段，并将所述的特异性DNA片段克隆到自杀载体上，得到整合自杀载体；