[发明专利]一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法

权利要求书

1.一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)构建靶向拟敲除质粒的整合自杀载体：扩增拟清除质粒的特异性DNA片段，并将所述的特异性DNA片段克隆到自杀载体上，得到整合自杀载体；

(2)整合自杀载体的筛选与转化：将所述的整合自杀载体转化到大肠杆菌感受态中，并利用抗生素筛选大肠杆菌转化子，然后将整合自杀载体从大肠杆菌转移到含有拟清除质粒的细菌中；

(3)细菌的第一轮筛选：通过抗生素筛选出整合自杀载体与拟清除质粒发生质粒整合的细菌；

(4)细菌的第二轮筛选：将步骤(3)中筛选出的细菌在无抗性培养基中培养，使整合后的质粒发生自然的清除，然后将细菌转移到含有自杀载体所带有的自杀基因的底物的培养基中，使含有整合后的质粒的细菌生长被抑制或被杀死，不含有整合后的质粒的细菌正常生长。

2.根据权利要求1所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的转移步骤通过细菌接合或电转化的方法将整合自杀载体转化到拟清除质粒的细菌中。

3.根据权利要求1所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的转移步骤通过热激的方法将提取纯化后的整合自杀载体转化到拟清除质粒的细菌中。

4.根据权利要求1所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的大肠杆菌含有λpir。

5.根据权利要求4所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的大肠杆菌为DH5αλpir、S17-1λpir或SM10λpir中的一种。

6.根据权利要求1所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的拟清除质粒的细菌为痢疾福氏志贺氏菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯菌或弗氏柠檬酸杆菌中的一种。

7.根据权利要求1所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的拟清除质粒的大小为24-340kbp。

8.权利要求1-7中任一项所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，在制备质粒消除药物或质粒消除试剂盒中的应用。

9.权利要求1-7中任一项所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，在制备抑菌药物、杀菌药物或疫苗中的应用。

10.权利要求1-7中任一项所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，在发酵生产领域或环保领域中的应用。