[发明专利]基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法

说明书

基于4‑羟基‑2,6‑二氟‑1,3,5‑苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，涉及多肽环化方法。先利用DFB在中性或碱性条件下与含有半胱氨酸的多肽发生芳香亲核取代反应合成环肽；基于以上DFB分子与含巯基多肽的高效生物相容的反应性质，构建噬菌体环肽库；在噬菌体上展示含有半胱氨酸的多肽库，利用DFB对多肽库进行环化，筛选出具有特异性结合的环肽配体。反应体系无需加入有机溶剂或金属催化剂，无需高温高压等剧烈条件，适用于生物体系。通过对环肽反应的产率、反应速率、环肽产物稳定性等理想的反应快速、产率高且结构稳定的环肽方法。针对靶标进行筛选，得到具有高亲和力的环肽配体，为发展多肽药物等提供可能。

技术领域

本发明涉及多肽环化方法，尤其是涉及一种基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法。

背景技术

多肽分子具有易于合成，与靶标亲和力强，选择性高等独特优势，因此被广泛应用于化学和生物医学领域。线性多肽在溶液中一般无稳定构象，在与靶标蛋白结合中表现出较弱的结合能力；其较为松散的结构易于暴露出更多的酶切位点，导致其易被蛋白酶酶解，限制了多肽在生物医学领域中的广泛应用。

通过环化将线性多肽的构象固定，不仅可以降低其构象自由度，减少其与靶标结合时的熵耗散，提升亲和性，还可以将部分酶切位点掩藏在环内部，降低其被酶解的概率，提升抗酶解稳定性。自然界中存在着的富含多个二硫键的多肽分子，比如芋螺毒素、动物防御素等依靠二硫键形成稳定的环结构，表现出优异的抗酶解稳定性以及特异性结合靶标的能力。(参见O.Saether,D.J.Craik，I.D.Campbell，K.Sletten,D.G.Norman.Biochemistry,1995,34,4147)。但是基于二硫键形成的环肽在还原环境中不稳定，易发生重排，且大部分不耐受酸碱和强氧化环境。相比于常见的利用二硫键构造的环肽，通过有机分子与多肽内氨基酸残基的偶联反应形成的硫醚键能够进一步提高环肽的稳定性。

噬菌体展示技术是一种基于生物定向进化原理的高通量筛选技术，将环化方法与生物分子定向进化技术结合正成为研究及应用的新趋势。目前，用于构建噬菌体环肽库的共价交联的方法主要集中于天然展示二硫键的噬菌体环肽库与利用翻译共修饰或翻译后修饰的方法展示碳硫键的噬菌体环肽库。后者在拓展结构多样且高质量的噬菌体环肽库中展现出巨大潜力，因此被广泛关注。噬菌体展示技术的突出特点是：(i)建立了在同一病毒颗粒内表型(展示多肽)与基因型(编码展示肽的DNA序列)之间的直接联系；(ii)巨大的库容量保证了展示多肽的多样性。经过3～5轮的体外筛选，特异性结合的噬菌体得到明显富集。通过挑取富集的单克隆菌落进行活化和基因测序，可获得噬菌体展示的多肽序列，其中重复或相似的片段称为“保守序列”。利用固相合成方法(SPPS)合成具有“保守序列”的多肽，通过荧光偏振

实验测定该多肽与靶标蛋白结合的亲和力，获得具有特异性结合能力的环肽配体。由于噬菌体展示反应体系的浓度极低，这进一步要求环化方法必须高效且选择性好。这些要求使得许多化学合成常用的环化方法并不适用于定向进化技术中。