[发明专利]基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法

权利要求书

1.基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)利用4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈在中性或碱性条件下与含有半胱氨酸的多肽发生芳香亲核取代反应合成环肽；所述含有半胱氨酸的多肽的序列为-CXnC-，其中C代表半胱氨酸，Xn代表n个随机氨基酸；

所述合成环肽的具体方法为：将含有半胱氨酸的多肽粉末溶于溶剂中得到多肽溶液A，将2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末溶解得到溶液B；在中性或碱性缓冲溶液中，加入多肽溶液A与硫醇还原剂，使多肽充分还原后，加入溶液B，反应得到环肽产物，用高效液相色谱与质谱分析及表征产物；

2)基于以上4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈分子与含巯基多肽的高效生物相容的反应性质，构建噬菌体环肽库；在噬菌体上展示含有半胱氨酸的多肽库，利用4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈对多肽库进行环化，筛选出具有特异性结合的环肽配体；

所述筛选出具有特异性结合的环肽配体的具体方法为：

(1)向滴度大于10¹³pfu/mL于氮端展示的含有两个半胱氨酸的噬菌体库中加入TCEP使终浓度为1mmol/L,还原噬菌体文库，加入溶液B使终浓度为1mmol/L，反应后加入PEG/NaCl溶液，置于冰上孵育以沉降噬菌体，沉降后离心，弃除上清液，取磷酸缓冲生理盐水重悬沉淀，即得到4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈修饰的噬菌体环肽库；

(2)对一元噬菌体环肽库进行筛选，洗涤除去未结合和低亲和的噬菌体，洗脱回收特异性结合的噬菌体并扩增，用于下一轮循环；经过多轮体外筛选，与靶蛋白结合的噬菌体得到有效富集；挑取菌落单克隆进行DNA测序，通过翻译测序结果得到与靶蛋白结合的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于在步骤1)中，所述溶剂采用水、乙腈或二甲亚砜中的一种；所述将2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末溶解得到溶液B是将2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末用乙腈溶解得到浓度为0.5mol/L的溶液B，用水稀释至50mmol/L、5mmol/L备用。

3.如权利要求1所述基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于在步骤1)中，所述硫醇还原剂采用三(2-羧乙基)膦盐(TCEP)；所述中性或缓冲溶液为pH≥7.0磷酸盐或碳酸盐缓冲溶液。

4.如权利要求1所述基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于在步骤1)中，所述多肽溶液A与硫醇还原剂中还原剂与多肽的比例≥1︰1；所述溶液B与多肽的比例≥1︰1。

5.如权利要求1所述基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于在步骤1)中，所述反应的温度为20～50℃，反应的时间为5min～12h。

6.如权利要求1所述基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于在步骤2)的第(1)部分中，硫醇还原剂采用5mol/L三(2-羧乙基)膦盐(TCEP)；所述PEG/NaCl加入总体积的1/5；冰上孵育的时间为0.5～1h；所述离心的条件为10000rpm离心10min。

7.如权利要求1所述基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于在步骤2)中的第(2)部分中，所述筛选以Keap1蛋白与Bcl-xl蛋白作为靶标蛋白进行筛选；所述多轮体外筛选是进行3～5轮体外筛选。