[发明专利]雄激素受体剪接变异体-7核酸定量检测方法、内标及试剂盒

说明书

本发明公开了雄激素受体剪接变异体‑7核酸定量检测方法、内标及试剂盒。所述试剂盒包括AR‑V7定量检测相关的引物探针组合、内标以及AR‑V7 RT‑PCR法检测相关试剂。且所述试剂盒可在单管内完成AR‑V7的定量检测，定量结果准确，极大的简化了常规的定量操作流程，提高了效率，也降低了检测失误的风险。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，特别是涉及及一种人雄激素受体剪接变异体-7核酸定量检测方法、内标及试剂盒。

背景技术

前列腺癌是一种常见的恶性肿瘤，并且是造成男性肿瘤死亡的第二大病因。近年来，我国前列腺癌的发病率呈逐年快速上升趋势，2004年为5.8/10万人，到2009年己经上升为8/10万人。由于我国对前列腺癌易感人群的筛查工作相对落后，导致晚期前列腺癌约占初次诊断的前列腺癌的70％，我国初诊为晚期前列腺癌的比例远高于欧美国家(20-30％)。雄激素剥夺治疗(Androgen deprivation therapy，ADT)是这类前列腺癌患者的最主要治疗方法。尽管在ADT治疗初期前列腺癌被不同程度的控制，但经过一段时间的治疗后，大部分患者的疾病逐渐且不可逆地进展为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistantprostate cancer，CRPC)。

目前已有的药物阿比特龙与蒽杂鲁胺对于CRPC患者的治疗有较好的效果，但仍然有20％-40％的患者PSA维持在较高的水平，却没有明显的疗效，且多数经阿比特龙与蒽杂鲁胺治疗的患者后期几乎都会发生获得性的耐药。关于阿比特龙与蒽杂鲁胺耐药的机制，文献资料显示，雄激素受体信号通路的异常属于耐药发生的可能机理之一，其中AR-V7是雄激素受体(AR)异常剪接所产生的构体，AR-V7由于缺少配体结合区，可以不依赖雄激素的结合而对下游的信号通路进行持续的活化，引起细胞的异常增殖。进一步的研究也表明，AR-V7阳性与经阿比特龙与蒽杂鲁胺治疗的CRPC患者的PSA响应率以及存活率呈明显的负相关。因此AR-V7的检测在表征CRPC患者治疗效果方面具有重要意义。

关于AR-V7的检测，目前市场上已有的仅用于科研服务的产品是凯杰公司生产的Adna Test Prostate Cancer Panel，检测的大概流程是：首先采用磁珠法捕获病人的循环肿瘤细胞(CTC)，之后进行mRNA的分离提取以及逆转录，最后通过qRT-PCR法完成AR-V7的定性检测，并不进行定量。

AR-V7常规的定量方法主要包括：ddPCR检测直接进行定量以及qPCR检测利用标准曲线进行定量。ddPCR检测比较明显的劣势在于操作流程繁琐，时间长，成本高。qPCR标准曲线定量，每次试验均需对标准曲线的配置与检测，操作繁琐。本发明提供的AR-V7定量检测试剂盒则可以在单管内实现AR-V7的定量检测，操作更加简单、快捷，且成本更低。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明通过单管内同步检测AR-V7以及AR-V7的内标(AR-V7 QS)，利用AR-V7 Ct值与AR-V7 QS Ct值的差值即ΔCt来对AR-V7进行定量。通常条件下，引物不同，则会导致引物的扩增效率不同，本发明提供的AR-V7与AR-V7 QS检测共用上下游引物，探针的设计碱基组成相同而排列顺序不同，进一步最大限度的保证了二者具有相同的扩增效率，从而可以直接利用ΔCt来直接对AR-V7进行定量。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：

本发明提供一种荧光PCR定量检测AR-V7的方法，包括：

S1、提供一包括AR-V7和已知浓度或模板量的AR-V7 QS内标的荧光PCR反应体系；

所述荧光PCR反应体系还包括用于检测AR-V7的上、下游引物及探针，以及用于检测AR-V7 QS的上、下游引物及探针，其中用于检测AR-V7的上、下游引物序列分别与用于检测AR-V7 QS的上、下游引物序列相同；