[发明专利]利用可溶性碳源葡萄糖生产纤维素酶的菌株及构建方法

说明书

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用可溶性碳源葡萄糖高效生产纤维素酶的菌株，还涉及上述菌株的构建方法。本发明所提供的利用可溶性碳源葡萄糖高效生产纤维素酶的菌株，其特征在于，所述的菌株是以木霉为出发菌株，利用木霉中的强效启动子——铜离子透性酶基因启动子Ptcu1在基因组上的pyr4基因位点定点过表达转录因子基因xyr1，在此基础上，进一步利用该启动子过表达胞外主要β‑葡萄糖苷酶基因bgl1构建的。本发明构建的菌株有效避免了在基因组上因随机插入可能导致的对纤维素酶表达的抑制作用；有效弥补了过表达xyr1产生的纤维素酶酶系中β‑葡萄糖苷酶活性的不足；可利用可溶性碳源葡萄糖高效生产纤维素酶，降低了生产工艺的复杂性。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用可溶性碳源葡萄糖高效生产纤维素酶的菌株，还涉及上述菌株的构建方法。

背景技术

里氏木霉（Trichoderma reesei）是一种十分高效的纤维素降解真菌，在纤维素存在的条件下，能表达分泌大量的纤维素酶以实现对纤维素的高效降解，因此被开发为重要的纤维素酶工业生产菌株。

经过多年研究，已经获得了多个里氏木霉纤维素酶高产菌株，其产酶性能也得到了极大的提高。但是目前纤维素酶的高成本依然是制约生物能源及大宗生物基产品工业化生产的一个瓶颈。

里氏木霉纤维素酶的表达受不溶性纤维素的高效诱导，但纤维素的不溶性在纤维素酶生产中存在许多缺点，如发酵操作过程复杂（包括灭菌、生物量测定、连续加料取样以及酶的分离纯化等），纤维素酶极易被吸附到不溶性纤维素上导致纤维素酶的损失，以及不溶性纤维素使得发酵过程中的搅拌、曝气等过程耗能增加。上述缺点使得不溶性纤维素不宜作为诱导物用于工业化生产纤维素酶。

葡萄糖是一种相对简单廉价的可溶性碳源，但以里氏木霉QM9414为产酶菌种时，纤维素酶几乎无法诱导表达。伍红等人在《碳源对里氏木霉QM9414胞外酶基因表达的影响》一文中披露：葡萄糖作为碳源时，在培养120小时之前，几乎未见纤维素酶活性；在培养120小时之后，出现了很低的酶活性。这种抑制可能是由于葡萄糖作为容易利用的碳源，产生了分解代谢阻遏抑制效应。可见，以葡萄糖作为碳源会抑制纤维素酶基因的表达。

构建利用可溶性碳源生产纤维素酶并且提升纤维素酶的表达水平和水解效率的菌株是解决该问题的有效策略。而里氏木霉纤维素酶基因的表达受转录激活因子Xyr1的调控，过表达该转录因子可有效提高纤维素酶的表达量，并且可实现在葡萄糖等非诱导物为碳源时纤维素酶的高效表达。尽管如此，过表达转录因子Xyr1之后，β-葡萄糖苷酶活性仍然不高。

因此，需要针对上述过表达转录因子Xyr1之后，β-葡萄糖苷酶活性仍然不高和葡萄糖作为碳源会抑制纤维素酶基因的表达等瓶颈问题进行解决，发明了一种进一步提高纤维素酶表达水平的菌株。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种以木霉例如里氏木霉QM9414为出发菌株，经过系列遗传操作后能利用可溶性碳源葡萄糖高效生产纤维素酶的菌株OXG1；该菌株（OXG1，以下内容中所提到的OXG1都代表本发明所构建的菌株）是以里氏木霉QM9414为出发菌株，利用里氏木霉QM9414中的强效启动子—铜离子透性酶基因启动子Ptcu1在基因组上的pyr4基因位点定点过表达转录因子基因xyr1，在此基础上，利用该启动子过表达胞外主要β-葡萄糖苷酶基因bgl1构建的。

本发明仅仅是以里氏木霉QM9414为例来说明如何以木霉为出发菌株构建产高活性纤维素酶的菌株OXG1的过程，但并不仅限于以上的里氏木霉QM9414菌株，还可以是其它的木霉菌株，类似的变换也是本发明所要保护的内容。