[发明专利]利用可溶性碳源葡萄糖生产纤维素酶的菌株及构建方法

权利要求书

1.利用可溶性碳源葡萄糖生产纤维素酶的菌株，其特征在于，所述的菌株是以木霉为出发菌株，利用木霉中的强效启动子铜离子透性酶基因启动子Ptcu1在基因组上的pyr4基因位点定点过表达xyr1转录因子，同时利用该铜离子启动子过表达胞外主要β-葡萄糖苷酶基因bgl1构建的。

2.如权利要求1所述的利用可溶性碳源葡萄糖生产纤维素酶的菌株的构建方法，其特征在于，所述的木霉为里氏木霉QM9414。

3.如权利要求1或2所述的利用可溶性碳源葡萄糖生产纤维素酶的菌株的构建方法，包括以下的步骤：

S1：用于高效表达转录因子基因xyr1和β-葡萄糖苷酶基因bgl1的质粒的构建：以里氏木霉基因组为模板，克隆出 pyr4 基因序列上下游各2kb的片段，将2个2kb的同源臂片段酶切后连入pMD19TS-hph中，从里氏木霉基因组序列上分别克隆1.7 kb的铜离子透性酶启动子Ptcu1和TtrpC 终止子序列，作为高水平表达相关功能基因的启动子和终止子，分别连入pMDhph-Lpyr4后得到质粒pLX1；

从里氏木霉基因组序列上克隆出xyr1基因序列通过AscI 和 NotI酶切后，连入质粒pLX1，得到xyr1基因的表达载体pLX1-xyr1；从里氏木霉基因组上克隆出3.2kb 的 bgl1 基因表达盒，将该片段酶切后连入pMD-Ptcu1-pyr4表达载体进而获得bgl1 过表达质粒 pMD-Ptcu1-pyr4-bgl1；

S2：高效表达转录因子基因xyr1和β-葡萄糖苷酶基因bgl1的菌株的构建：将S1中pLX1-xyr1载体经线性化后转化至里氏木霉QM9414菌株中，通过在pyr4 基因位点发生同源双交换的原理，同时利用5-氟乳清酸和潮霉素抗性筛选得到阳性转化子转化子，从而获得定点整合于pyr4基因位点的尿苷营养缺陷型的xyr1过表达菌株OEX9；

在xyr1过表达菌株OEX9的基础上，将bgl1的过表达质粒pMD-Ptcu1-pyr4-bgl1质粒转入其中，利用不含尿苷的基本培养基筛选原养型转化子，进而通过PCR验证相关基因在里氏木霉基因组上的插入情况，最终得到同时过表达xyr1基因和bgl1 基因的菌株OXG1。