[发明专利]一种尿苷磷酸酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种尿苷磷酸酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，能够有效催化核糖‑1‑磷酸与烟酰胺反应生成烟酰胺核糖，并可与嘌呤核苷磷酸化酶和烟酰胺核糖激酶一起构成三酶体系联合催化原料鸟苷、磷酸盐、烟酰胺和ATP反应一锅法合成β‑烟酰胺单核苷酸，具有较好的工业化开发和应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程和酶催化技术领域，具体地说，涉及一种尿苷磷酸酶突变体、及其在合成烟酰胺核糖和β-烟酰胺单核苷酸中的用途。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide，简称β-NMN或者NMN)广泛存在于自然界的生物中，是NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又叫辅酶I)的直接前体，而NAD是细胞内众多生化反应进行的重要辅酶。NMN摄入机体细胞后，可在NMNAT酶催化作用下，合成NAD，通过NAD来体现其功能。经研究，NMN具有增强免疫力、抗衰老、修复DNA损伤、增强耐力、解酒护肝、增强胰岛素敏感性、保护视力和听力等作用。

目前，文献报道的β-NMN的制备方法有三种，包括化学合成、酶催化法以及微生物发酵法。化学合成方法以烟酰胺和核糖为原料，核糖经基团保护获得四乙酰核糖，然后再与烟酰胺反应，再经脱保护获得烟酰胺核糖(NR)，最后在磷酸化获得NMN，反应体系成分复杂、分离提取难度大，收率低，生产过程涉及较多的有机溶剂，如三氟甲磺酸三甲硅酯、甲醇、二氯甲烷等，生产环保压力较大。酶催化有两种方案，一是以NR、ATP(三磷酸腺苷二钠)为底物，在其激酶的催化下合成NMN；另一种是以核苷、烟酰胺和ATP为底物多酶体系下催化合成NMN，但由于NMN在细胞内容易被降解，因此多采用纯酶体系来催化，这导致了较高的生产成本。微生物发酵法仅有少量文献报道，产量均在毫克每升，还没有工业应用的价值。

随着近年来对NMN功能的深入了解，NMN的需求也呈现快速的增长，但高昂的价格也限制了其广泛应用，因此开发高效、低廉的NMN酶法合成工艺成为该产品的关键。我们在研究中发现，尿苷磷酸酶可以与嘌呤核苷磷酸化酶和烟酰胺核糖激酶一起构成三酶体系联合催化原料鸟苷、磷酸盐、烟酰胺和ATP反应一锅法合成β-烟酰胺单核苷酸，但现有技术的尿苷磷酸酶的低酶活力成为了酶促合成NMN的制约因素。

发明内容

本发明为了克服尿苷磷酸酶对烟酰胺底物活性低的问题，本发明利用基因工程技术对大肠杆菌来源的尿苷磷酸酶(又称尿嘧啶核苷磷酸化酶，Uridine phosphorylase)进行改造和筛选，对其烟酰胺底物特异性及催化活力进行了改进，同时与嘌呤核苷磷酸化酶和烟酰胺核糖激酶共同作用实现多酶体系联合催化一锅合成NMN。具体来说，本发明包括如下技术方案：

一种尿苷磷酸酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：

MSKSDVFHLGLTKNDLQGATLAIVPGDPDRVEKIAALMDKPVKLASHREFTTWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEELAQLGIRTFLRIGTTGAIQPHINVGDVLVTTASVRLDGASLHFAPLEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTGYPGQERYDTYSGRVVRHFKGSMEEWQAMGVMNAEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVGSNRTQQEIPNAETMKQTESHAVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:3)。

其为大肠杆菌Escherichia coli K-12来源的尿苷磷酸酶SEQ ID NO:1(GenBank序列号为P12758)第162位的F替换为G、第195位的Y替换为A、第220位的I替换为G的突变体、第221位的V替换为S的突变体。

本发明的第二个方面在于提供编码上述尿苷磷酸酶突变体的基因。

优选地，编码上述尿苷磷酸酶突变体SEQ ID NO:3的基因可以是下述核苷酸序列SEQ ID NO:4：