[发明专利]一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物及其应用

说明书

本发明公开了一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物及其应用，该组引物包括7个点位所对应的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14所示；在对墨地龙冬瓜进行杂交种纯度鉴定时，首先提取待检测样品种子的基因组DNA作为模板，然后利用上述引物进行PCR扩增，最后通过电泳对扩增产物进行检测，通过对父母本与杂交种的带型进行比对，得到真杂交种数与可观测到条带的种子总数的比例，即杂交纯度。本发明提供的InDel标记可实现对亲本及杂交种的有效区别，鉴定成本低、效率高，且鉴定结果与田间鉴定结果的吻合度达99％以上。

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，特别地，涉及一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物及其应用。

背景技术

分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的新遗传标记形式，它以蛋白质、核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构与其变异，可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题，因此被广泛应用于遗传育种、基因定位和多样性分析中。在植物遗传研究中常用的分子标记方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)和简单重复序列标记(SSR)等，但上述技术存在如下缺陷：RFLP需要放射性同位素的参与，技术较复杂；RAPD实验重复性较差，结果可靠性较低；SSR相比前两者较为简单、便宜，重复性较好，但有些扩增条带不清楚及出现假等位基因、无效等位基因等技术缺陷，导致SSR标记在基因型分型和数据分析上容易产生错误。近年来，随着基因组测序技术的快速发展，出现了包括InDel和SNP在内的第三代新型分子标记类型，其具有经济实用、特异性高、稳定性好等特点。

InDel标记指的是在近缘种或同一物种的不同个体间同源序列的等位基因位点上插入或缺失一定的核苷酸片段的分子标记。InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多。就分布密度而言，InDel仅次于SNP，但远高于SSR，而SNP受限于基因型分型技术，在小型和中型检测中需要特殊的设备，成本高且操作复杂。因此，InDel标记的应用前景广阔。

目前，我国对于冬瓜商品种的杂交纯度鉴定基本采用田间鉴定法，即根据作物在形态学上的表现来判断种子是否为杂交，该方法检测周期长、费时费工、土地占用面积大，加之可用于鉴定杂交种纯度的形态特征数量有限，且多数形态特征还易受环境影响，不能满足当年生产需要。

事实上，我国关于冬瓜分子标记开发利用方面的研究相对较少，也尚未有涉及冬瓜InDel标记应用的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物及其应用，以解决背景技术中提出的问题。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一组墨地龙冬瓜InDel分子标记引物，包括7个点位所对应的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14所示。

将上述InDel分子标记引物应用于对墨地龙冬瓜杂交种进行纯度鉴定。

鉴定方法为：首先提取墨地龙冬瓜待检测样品种子的基因组DNA作为模板，然后利用所述InDel分子标记引物进行PCR扩增，最后通过电泳对扩增产物进行检测，通过对父母本与杂交种的带型进行比对，得到真杂交种数与可观测到条带的种子总数的比例，即杂交纯度。

所述鉴定方法具体包括如下步骤：

1)预处理：对墨地龙冬瓜的杂交种子进行温汤浸种，浸种完成后用清水冲洗掉种子表面的粘液，然后将种子置于清水中在室温下保存8～12小时，沥干水分备用；

2)DNA提取：对步骤1)所得的种子进行催芽生根，待胚根长至1cm以上时选取根尖组织加入碱液并用沸水加热，然后加入缓冲液进行中和，将提取液冷却至室温；

3)PCR扩增：以步骤2)所得的提取液中的DNA为模板，加入至少一对InDel分子标记引物进行PCR扩增，获得扩增产物；