[发明专利]一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合、测序方法及其应用

说明书

本发明提供了一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合、测序方法及其应用，涉及高通量测序技术领域。所述引物组合包括5对引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示。本发明还提供了用于线粒体高变区的高通量基因测序的方法，所述方法包括利用SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示引物组合构建测序文库；采用高通量测序的方法对所述测序文库进行检测。本发明提供的用于线粒体高变区复合扩增的引物组合以及测序方法能够同时检测多个样本的线粒体高变区基因，有效提高检测效率、准确率、灵敏度，同时降低了成本、简化了操作步骤，通过单管反应即可获得检测结果。

技术领域

本发明涉及高通量测序技术领域，尤其是涉及一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合、测序方法及其应用。

背景技术

线粒体DNA(mtDNA)作为一种独立存在的遗传物质，其高突变率是造成其遗传多样性的重要原因，不仅是个体身份识别不可或缺的技术手段，也是研究母系群体进化迁移的生物学工具。人类mtDNA为环状双链结构，长16569bp，线粒体DNA的非编码区(也称为控制区)，控制区的碱基变异相对集中分布在15996-16401和29-408区段，分别称为HV1和HV2，后有研究者发现438-574之间也存在较多的碱基变异，称为HV3。当在单个个体中存在不止一种类型的mtDNA(即出现两种或两种以上的碱基序列)时，这种现象称mtDNA的异质性。

检测不同水平的mtDNA异质性，需要依靠具有不同灵敏度的不同检测方法。DNASanger测序目前仍是金标准，但是只能检测出mtDNA异质性大于10-15％或10-20％以上的位点。时相温度梯度凝胶电泳(temporal temperature gradient gel electrophoresis，TTGE)可以检测到突变频率为4％的mtDNA异质性位点。变性高效液相色谱(Denaturinghigh performance liquid chromatography，DHPLC)是一种高通量的基因突变检测技术，可以检测到突变频率为1％的mtDNA异质性位点，因此DHPLC技术在个体身份识别领域应用比较广泛。随着测序技术的发展，高通量测序技术由于其高覆盖度、高灵敏度及低成本等优势倍受研究人员青睐，也逐步应用于mtDNA异质性研究，但是目前还没有形成统一标准，使用不同的仪器、化学试剂以及不同的异质性评判标准，各实验室之间的检测结果也会有很大的差异。由于mtDNA异质性在疾病、个体身份识别、亲子鉴定和犯罪嫌疑人认定等方面均有重要意义，因此提高mtDNA异质性检测的灵敏度就尤为必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合、测序方法及其应用，本发明提供的用于线粒体高变区复合扩增的引物组合以及测序方法剂能够同时检测多个样本的线粒体高变区基因，有效提高检测效率、准确率、灵敏度。

本发明是通过以下技术方案实现的：

在一方面，本发明提供了一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合，所述引物组合包括5对引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；以及SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

在另一方面，本发明提供了一种用于线粒体高变区的高通量基因测序的方法，所述方法包括利用本发明所述引物组合构建测序文库；采用高通量测序的方法对所述测序文库进行检测。

在一个实施方案中，利用本发明所述引物组合构建测序文库包括：

(a)利用本发明所述引物组合对不同样本的线粒体高变区基因进行PCR扩增，得到第一扩增产物；

(b)以第一扩增产物为模板进行接头序列PCR扩增反应及产物纯化，得到包含所述线粒体高变区基因的测序文库。