[发明专利]一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合、测序方法及其应用

权利要求书

1.一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括5对引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；以及SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

2.一种用于线粒体高变区的高通量基因测序的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的引物组合构建测序文库；采用高通量测序的方法对所述测序文库进行检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述利用权利要求1所述的引物组合构建测序文库包括：

(a)利用权利要求1所述的引物组合对不同样本的线粒体高变区基因进行PCR扩增，得到第一扩增产物；

(b)以第一扩增产物为模板进行接头序列PCR扩增反应及产物纯化，得到包含所述线粒体高变区基因的测序文库。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，在PCR扩增体系中，引物按终浓度不同分为三组，

A组：SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示序列的引物，

B组：SEQ ID NO.7所示序列的引物，

C组：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示序列的引物；

三组引物终浓度的比例A组：B组：C组为2：4：1，优选地，三组引物终浓度A组：B组：C组分别为0.2μM：0.4μM：0.1μM。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤(a)和所述步骤(b)之间还包括纯化的步骤，优选进行磁珠纯化，更优选经AMPure XP磁珠纯化。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤(b)中，在将已纯化PCR产物进行末端修复、将修复末段连接接头和连接有接头的产物磁珠纯化后，再进行接头序列PCR扩增。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述接头序列PCR扩增过程中使用i7引物以及i5引物进行扩增，所i7引物以及i5引物的序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述采用高通量测序的方法对所述测序文库进行检测包括进行文库定量、高通量检测和数据分析；

优选地，高通量测序采用MiSeq FGx测序；

优选地，所述数据分析为采用NextGENe软件分析突变位点、变异频率、突变类型和/或覆盖深度。

9.一种基于高通量测序测序技术用于mtDNA异质性检测的方法，所述方法包括通过权利要求2-8任一项所述的方法获得数据分析结果，根据数据比对分析确定高通量测序样本的单倍型，然后进行mtDNA异质性分析。

10.权利要求1所述的引物组合在构建用于检测线粒体高变区基因变异的高通量测序文库中的应用。