[发明专利]一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体

说明书

本发明公开了一种Arthrobacter sp.AW19M34‑1几丁质脱乙酰酶突变体，将海洋细菌Arthrobacter sp.AW19M34‑1几丁质脱乙酰酶氨基酸序列进行了如下突变：172位赖氨酸K突变为谷氨酸E，200位谷氨酸E突变为酪氨酸Y，201位丝氨酸S突变为色氨酸W，其中Arthrobacter sp.AW19M34‑1几丁质脱乙酰基酶基因密码子优化序列如附录1所示，其中海洋细菌Arthrobacter sp.AW19M34‑1几丁质脱乙酰酶氨基酸序列GenBank收录号为AW19M34‑1；本发明通过定点突变改造几丁质脱乙酰酶基因，使所编码的几丁质脱乙酰酶催化活性增加，酶的其它催化特性基本不变，突变酶催化晶体几丁质脱乙酰活性是野生型酶的2.57倍，具有更高的经济价值和社会价值，值得推广。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，公开了海洋细菌一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体。

背景技术

几丁质(Chitin)，又称甲壳素，由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)通过β-(1, 4)键连接而成，主要存在于节肢动物外骨骼、软体动物内骨骼、真菌和硅藻细胞壁中，是自然界中含量第二丰富的多糖，几丁质虽含量丰富，但不溶于水和一般有机溶剂，严重限制开发应用。壳聚糖(Chitosan)是几丁质脱去55%以上乙酰基的产物，也称脱乙酰甲壳素，壳聚糖分子链上的游离氨基使其溶解性能优于几丁质，随着壳聚糖脱乙酰度增高，其分子链上的游离氨基增多，溶解性能也越好；此外壳聚糖还具有抗菌、抗癌、降低胆固醇、降血压等生物活性，广泛应用于医药、食品、化工、环保、农业和化妆品等领域。我国是世界最大的壳聚糖生产国和出口国，年产量超过3.5万吨，其中90%用于出口。目前，壳聚糖的生产全部采用化学浓碱法，将几丁质浸于浓碱中进行高温反应，其生产的壳聚糖主链中N-乙酰氨基葡糖和氨基葡糖分布不均匀，存在溶解性差，平均分子质量和脱乙酰度不稳定等缺点，同时化学浓碱法不仅耗时长、耗能高，还会排放大量浓碱废液，对环境造成严重污染。几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase，CDA) 是一种可以催化几丁质脱去乙酰基的碳水化合物酶，可被用于壳聚糖的生物酶法生产，生物酶法制备的壳聚糖具有脱乙酰程度一致、脱乙酰度高、分子质量分布范围窄等优点，更为关键的是，生物酶法反应条件温和、耗能低，生产过程绿色环保，无有害废弃物，是节能、环境友好型的技术，可实现壳聚糖的绿色生产。

目前只几丁质脱乙酰酶可以催化晶体几丁质脱去乙酰基在工业应用中的成本较高，生物酶法制备壳聚糖难以扩大规模。本发明公开了来自海洋细菌Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰酶，可催化晶体几丁质脱乙酰基的几丁质脱乙酰酶。ArCE4的基因序列已经测定(GenBank Accession No. LT630322.1)，三级结构和催化脱乙酰机制也已经明确，由于ArCE4源于原核微生物，易于在大肠杆菌中可溶性表达，因此本发明将其分子改造，获得了一种高效催化晶体几丁质脱乙酰活性增加的突变酶。

发明内容

本发明将海洋细菌Arthrobactersp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶进行了突变，相较于突变前，突变体酶的比活力是野生型酶2.57倍，大大提高了几丁质脱乙酰酶催化效率，更加适合工业化生产需求，其具体方案如下：