[发明专利]一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体

权利要求书

1.一种Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体，其特征在于：将海洋细菌Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰酶氨基酸序列进行了如下突变：172位赖氨酸K突变为谷氨酸E，200位谷氨酸E突变为酪氨酸Y，201位丝氨酸S突变为色氨酸W，所述Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰基酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述的Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的质粒，所述质粒为pET21a(+)。

4.携带权利要求2所述基因的细胞，所述细胞为用于克隆的感受态细胞E.coli DH5α或用于表达的感受态细胞E.coli BL21（DE3）。

5.一种如权利要求1所述的Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的制备方法，其特征在于：通过设计引物对编码几丁质脱乙酰酶的基因进行定点突变后表达，具体包括如下步骤：

（1）以野生型酶基因为模板设计引物进行突变，将突变基因与pET21a连接，形成突变后的质粒，其中野生型酶基因GenBank收录号为LT630322.1；

（2）将突变后的质粒转化进入E.coli DH5α进行扩增；

（3）将含有编码突变几丁质脱乙酰酶的基因的重组菌E.coli BL21（DE3）活化培养后发酵培养，获取发酵菌；

（4）破碎发酵菌体，离心收集上清液，制备获得Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的粗酶液；

（5）按照His60 Ni Gravity Column Purification Kit说明书进一步纯化。

6.根据权利要求5所述的一种Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的制备方法，其特征在于：所述定点突变的引物如下：

ES200YW primer F：ACATTCACTATTGGAGCGTGAAGGCGGTTCCGCAG

ES200YW primer R：TTCACGCTCCAATAGTGAATGTCGTGCATCAGAATG

K172E primer F：GTTGACACGCTGGATTGGGAGCACCACGACCCACAAAAG

K172E primer R：CTTTTGTGGGTCGTGGTGCTCCCAATCCAGCGTGTCAAC。

7.根据权利要求5所述的一种Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的制备方法，其特征在于：所述发酵培养具体操作为：将含有编码突变几丁质脱乙酰酶的基因的重组菌E.coli BL21（DE3）活化培养后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中，接种量为1%，于37℃200r/min培养至OD600为0.6，加入终浓度0.5mM IPTG，30℃诱导发酵12h，发酵结束后在4℃、12000r/min条件下冷冻离心5min收集菌体，收集的菌体按照1g菌体用10mL 50mM Tris-HCl重悬，所述Tris-HCl的pH 为8.0，并以超声波细胞粉碎仪破碎菌体，在4℃、12000r/min条件下冷冻离心5min，收集上清液作为粗酶液。

8.根据权利要求7所述的一种Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的制备方法，其特征在于：所述超声波细胞粉碎仪共超声5min，每超声5s暂停5s。

9.根据权利要求7所述的一种Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的制备方法，其特征在于：所述氨苄青霉素的发酵培养基组成包括胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，培养基pH7.0。