[发明专利]一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体

说明书

本发明公开了一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，其特征在于：将Bacillus sphaericus蛋白酶基因进行如下突变：39位苏氨酸（T）突变为脯氨酸（P），87位谷氨酰胺（Q）突变为脯氨酸（P），108位丝氨酸（S）突变为甘氨酸（G），172位酪氨酸（Y）突变为谷氨酸（E），198位天冬酰胺（N）突变为色氨酸（W），所述Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体基因密码子优化序列如附录1所示，所述Bacillus sphaericus氨基酸序列GenBank收录号为AJ238598.1；本发明公开的Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，相较于突变前，突变酶的有机溶剂耐受性是野生型酶的3.15倍，突变蛋白酶对有机溶剂的耐受性更好，更加适合工业生产的要求。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体。

背景技术

蛋白酶是一类水解酶，可以催化蛋白质和多肽中肽键的水解，属于第3类水解酶的第4亚类（EC 3.4），由于蛋白酶在催化反应时具有反应速度快、条件温和、高专一性、高选择性等诸多优点，被广泛的应用于蛋白质、洗涤剂、食品、制药、制革等许多领域，但由于工业应用过程中的苛刻条件如：高温、强酸、强碱及化学有机溶剂等，蛋白酶容易失去活性，在这些极端条件下的低稳定性极大地限制了蛋白酶在各个领域的应用。

近年来，非水酶学迅速发展，进一步拓展了蛋白酶在有机合成领域的应用，与传统的水相催化相比，使用有机溶剂作为催化介质有很多优点：（1）可以提高非极性底物或产物的溶解性；（2）可以进行不能在水相中进行的合成反应，控制反应进行的方向；（3）可以减少产物对酶的反馈抑制作用：（4）可以提高手性化合物不对称反应的对映选择性；（5）有机溶剂介质种类较多，可以根据反应需要选择；（6）可以提高酶使用的连续性；（7）反应所得的产物易于纯化回收；（8）可以控制放反应的的进程，得到特定的反应中间体，帮助研究反应机制。然而大多数天然蛋白酶在有机溶剂中的稳定性极差，易失去活性，这极大的限制了蛋白酶在有机合成领域的应用。目前已有大量的研究表明通过溶剂工程和生物催化工程可以提高酶对有机溶剂的耐受性，但这些方法不仅成本高，且易导致酶活性下降，因此获得天然有机溶剂稳定性蛋白酶或利用蛋白质工程改造蛋白酶，以增加其有机溶剂耐受性，可以显著降低成本，因此本发明基于酶工程尤其是定向进化技术的快速发展，为提高酶的有机溶剂耐受性提供了新的方法：通过利用定点突变、定点饱和突变、DNA-shuffling等技术可以改善酶的有机溶剂耐受性，使之更好的满足工业催化中的需要。

发明内容

本发明提供了一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，通过定点突变改造蛋白酶酶基因，使所编码的蛋白酶的有机溶剂耐受性增加，突变酶的有机溶剂耐受性是野生型酶的3.15倍，更加适合工业化生产需求，满足社会生产的要求，具体技术方案如下：

一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，其特征在于：将Bacillussphaericus蛋白酶基因进行如下突变：39位苏氨酸（T）突变为脯氨酸（P），87位谷氨酰胺（Q）突变为脯氨酸（P），108位丝氨酸（S）突变为甘氨酸（G），172位酪氨酸（Y）突变为谷氨酸（E），198位天冬酰胺（N）突变为色氨酸（W），所述Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体基因密码子优化序列如附录1所示，所述Bacillus sphaericus氨基酸序列GenBank收录号为AJ238598.1。

进一步的，编码Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的基因。

进一步的，携带权利要求2所述基因的质粒和细胞，其中质粒为ppicZalphA，用于克隆的感受态细胞：E. coli DH5α；用于表达的感受态细胞：Pichia Pastoris X33。