[发明专利]一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体

权利要求书

1.一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，其特征在于：将Bacillus sphaericus蛋白酶基因进行如下突变：39位苏氨酸（T）突变为脯氨酸（P），87位谷氨酰胺（Q）突变为脯氨酸（P），108位丝氨酸（S）突变为甘氨酸（G），172位酪氨酸（Y）突变为谷氨酸（E），198位天冬酰胺（N）突变为色氨酸（W），所述Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体基因密码子优化序列如附录1所示，所述Bacillus sphaericus氨基酸序列GenBank收录号为AJ238598.1。

2.根据权利要求1所述的一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，其特征在于：编码Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体，其特征在于：携带权利要求2所述基因的质粒和细胞，其中质粒为ppicZalphA，用于克隆的感受态细胞：E. coli DH5α；用于表达的感受态细胞：Pichia Pastoris X33。

4.一种如权利要求1所述的Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的制备方法，其特征在于：将Bacillus sphaericus蛋白酶基因sph序列进行密码子优化，通过设计引物对编码蛋白酶的基因进行定点突变后表达，具体包括如下步骤：

（1）以质粒ppicZalphA为模板设计引物进行突变；

（2）将突变后的质粒转化进入E. coli DH5α 进行扩增；

（3）以Pichia Pastoris X33表达含突变基因的重组质粒，得到耐有机溶剂性增强的蛋白酶突变体；

（4）将含有编码蛋白酶的基因的重组P. pastoris X33 (ppicZalphA-sph)进行甲醇诱导表达，发酵培养获取蛋白酶粗酶液。

5.根据权利要求4所述的一种Bacillus sphaericus耐有机溶剂蛋白酶突变体的制备方法，其特征在于：所述定点突变的引物如下：

F-T39P：5’-TGGTGTCAACCCATCTCACCCAGACTTGGTTAACAACGT-3’

R-T39P：5’-TCTGGGTGAGATGGGTTGACACCAGTGTCCAAAACAGCA

F-Q87P：5’-GGTGGTTCTGATCCAGCTGGTATCTACGGTGTTGCT-3’

R-Q87P：5’-TAGATACCAGCTGGATCAGAACCACCATCAGCCAA-3’

F-S108G：CAAGGTTTTGTTGGACGGTGGTTCTGGTTACTCCGATGA

R-S108G：CGGAGTAACCAGAACCACCGTCCAACAAAACCTTGTAGGCC

F-Y 172 E：GCTGCTGGTAACTCTGGTGAAGCTCAAGGTACTATTGGATACC

R-Y172 E：AATAGTACCTTGAGCTTCACCAGAGTTACCAGCAGCAGCGAC

F- N198W：CTTGGAGAACGTTCAACAGTGGGGTACTTACAGAGTTGCCGACTA

R-N198W：CGGCAACTCTGTAAGTACCCCACTGTTGAACGTTCTCCAAGGCAG。