[发明专利]一种改良人脐带间充质干细胞培养基和人脐带间充质干细胞分离纯化方法

说明书

本发明公开提供了一种改良人脐带间充质干细胞培养基和人脐带间充质干细胞的分离纯化方法，所述培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为UltraCulture无血清培养基，添加物各组分及浓度为：1.0%‑5.0%血清替代物，1.0‑10.0mM烟酰胺，0.5‑5nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。本发明还公开了一种人脐带间充质干细胞的分离纯化方法，即采用组织培养法结合混合酶消化法，可快速、高效分离得到数量大，纯度高，状态好的脐带间充质干细胞，既缩短原代培养时间，又简便易操作。利用本发明可提高脐带组织的利用率和间充质干细胞得率，并且细胞纯度高，活性好，可满足临床应用的要求。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，涉及一种改良人脐带间充质干细胞培养基和人脐带间充质干细胞的分离纯化方法。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）来源于早期的中胚层和外胚层，最初在骨髓中发现，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。近年来研究发现间充质干细胞对心脑血管疾病、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤及自身免疫性疾病等有明显疗效，参与机体免疫调节和细胞生长。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells ，huc-msc）是存在于新生儿脐带华通胶和血管周围组织中的一种间充质细胞，具有来源广泛，取材方便，增殖能力强，细胞表型稳定，免疫原性低等优点，并且可分泌大量细胞因子参与机体免疫调节，是临床研究与应用的合适材料来源，具有广泛的应用前景。

目前，脐带间充质干细胞的分离方法主要集中在组织贴壁法和酶解法。组织贴壁法制备脐带间充质干细胞所需时间长，操作难度大，接种过程容易污染，原代细胞迁出率较低等因素使得组织贴壁法并未得到批量化应用。酶消化法一般采用胰蛋白酶和胶原酶结合消化脐带组织华通氏胶进行培养，由于经济成本高，消化时间长，消化率难以把控，容易造成过度消化，细胞贴壁率降低并且大量死亡。因此，亟需开发一种适用于脐带间充质干细胞增殖的培养基和一种高效、安全的脐带间充质干细胞分离纯化方法，为干细胞的临床治疗应用提供有力的技术保障。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种改良人脐带间充质干细胞培养基和人脐带间充质干细胞的分离纯化方法，使用该制备方法可促进细胞快速稳定增殖，缩短消化时间，减少细胞损伤，提高细胞得率，降低成本，简化操作。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种改良人脐带间充质干细胞培养基包括基础培养基和添加物，所述添加物各组分及浓度为：1.0-5.0%血清替代物，1.0-10.0mM烟酰胺，0.5-5nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。

其中，基础培养基为间充质干细胞无血清培养基。

其中，添加物及各组分浓度：1.0-5.0%血清替代物，1.0-10.0mM烟酰胺，0.5-5nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。

其中，添加物各组分及浓度为：2.0%血清替代物，5mM烟酰胺，1nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。

为解决上述技术问题，本发明提供一种人脐带间充质干细胞分离纯化方法，包括以下步骤：

（1）采集脐带样本：取足月健康分娩的胎儿脐带10-15 cm置于含1%双抗的生理盐水的采集瓶中，室温下运送至实验室，采集样本需在6 h内进行分离操作；

（2）样本预处理：将脐带样本从采集瓶中取出，置于75%酒精中处理15-30秒，生理盐水洗涤3次，去除残留酒精；

（3）获得华通氏胶：将10-15cm的脐带样本剪成2.0-3.0cm小段，剔除血管，置于含1%双抗的生理盐水中，漂洗去除残留血渍；