[发明专利]一种改良人脐带间充质干细胞培养基和人脐带间充质干细胞分离纯化方法

权利要求书

1.一种改良人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加物，所述添加物各组分及浓度为：1.0-5.0%血清替代物，1.0-10.0mM烟酰胺，0.5-5nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。

2.根据权利要求1所述的改良人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为间充质干细胞无血清培养基。

3.根据权利要求1所述的改良人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，所述添加物及各组分浓度：1.0-5.0%血清替代物，1.0-10.0mM烟酰胺，0.5-5nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。

4.根据权利要求1所述的改良人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，所述添加物各组分及浓度为：2.0%血清替代物，5mM烟酰胺，1nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。

5.一种改良人脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采集脐带样本：取足月健康分娩胎儿脐带10-15 cm置于含1%双抗的生理盐水的采集瓶中，室温下运送至实验室，采集样本需在6 h内进行分离操作；

（2）样本预处理：将脐带样本从采集瓶中取出，置于75%酒精中处理15-30秒，生理盐水洗涤3次，去除残留酒精；

（3）获得华通氏胶：将10-15cm的脐带样本剪成2-3cm小段，剔除血管，置于含1%双抗的生理盐水中，漂洗去除残留血渍；

（4）剪碎处理：先用15 cm眼科剪将其剪至0.5-1.0cm 小段，后用10 cm眼科剪将其均匀剪碎至1mm³组织碎块，在剪碎的过程中即加入1 ml胶原酶Ⅱ进行预消化，收集剪碎组织于50 ml蓝盖瓶中；

（5）混合酶消化：根据脐带组织的长度（厘米）：混合酶（毫升）=1:1.5确定加入混合酶消化的量，置于37℃水浴摇床，250 rpm消化2.5-3.0小时；

（6）离心收集细胞：用70 um筛网将消化后的悬液过滤到50 ml离心管中，用D-Hanks液稀释，1000 g离心10 min，弃上清，重复2次；

（7）细胞接种：将离心收集细胞用完全培养基接种至T-75细胞培养瓶中，37℃，5% CO₂培养箱中培养，培养得到细胞即为P0代；

（8）传代培养：待P0代密度达到80-90%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化收集并传代培养，消化传代得到的细胞即为P1代，其传代比例1:3-5；

（9）细胞质检，待P2融合度达到80%即进行细胞质检，包括无菌检测，支原体检测，内毒素检测，流式细胞表型检测及分化能力检测。

6.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述混合酶消化法中消化液包括5%中性蛋白酶，5%透明质酸酶，10%胶原酶Ⅱ和混合酶稀释液。

7. 根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述所述混合酶液的加入量为脐带组织长度（厘米）：混合酶（毫升）=1:1.5，消化条件为水浴摇床37℃，250 rpm消化2.5-3.0小时。

8.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，传代培养时P0代细胞融合度达到80-90%，传代时间间隔2天，传代比例1:4。

9.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，细胞质检时检测P3代培养细胞表面标记物，即CD73-APC、CD90-FITC和CD105-PerCP阳性率均大于95%，CD45-PE、CD34-PE 、CD11b-PE、CD19-PE、HLA-DR-PE阳性率均低于2%。

10.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，细胞质检过程中，微生物检测，支原体检测均为阴性，内毒素检测小于≤0.5EU/mL，传代培养的脐带间充质干细胞具有成骨，成脂，成软骨分化能力。