[发明专利]一种利用鸳鸯粪便分析鸳鸯食性的方法

说明书

本发明公开一种利用鸳鸯粪便分析鸳鸯食性的方法，属于动物食性研究技术领域。本发明所述方法包括采样、提取全基因组DNA，然后进行PCR扩增后送测序，最后进行生物信息的处理与分析，从而得到鸳鸯粪便中的植物种类。本发明所述方法不依赖于研究者的形态学经验和主观判断，对形态相似的近缘属和隐存属可以准确区分，不受食物消化程度和硬质残留的局限，可以分析几乎所有食物成分中植物类型，具有极高的灵敏度，微量的食物DNA也可以被检测到，能对来自不同鸳鸯粪便的混合DNA样品进行测序；大大降低了分析成本和时间。

技术领域

本发明公开一种利用鸳鸯粪便分析鸳鸯食性的方法，属于动物食性研究技术领域。

背景技术

鸳鸯俗称官鸭，属于国家二级保护动物，也是我国著名的观赏水禽。鸳鸯不但可以作为观赏鸟类，也是一种具有很高营养价值和药用价值的品种，但是由于自然界生态环境的改变，野生的鸳鸯已经越来越少了，为了保护、开发和利用这一优良的资源，需要对鸳鸯的食性进行研究。动物的食性研究对于动物种群的动态，生态学和进化的了解有着重要的贡献，食性的了解能够促进对该动物的有效管理和保护。至今为止，有很多种测定方法对动物食性进行研究，常见的有粪便显微分析法和粪便DNA分析法。

粪便显微分析法为：采集研究地区植物进行种属鉴定,制备每种植物的显微参考装片。将收集的粪便样品烘干后研磨后进行显微装片的制备，在显微镜下观察粪便中未被消化的植物角质表皮碎片的细胞结构与制备好的植物显微参考装片进行对比分析，得到动物取食的种类及数量。粪便DNA分析法：该方法通过提取动物粪便中的DNA，利用PCR技术扩增从而判断动物的食物组成。上述方法均存在一定的局限性，其中，粪便显微分析法的技术难点之一是在装片过程中植物碎片难均匀分开，并常发生卷曲和重叠，影响植物碎片的识别，从而影响结果的分析。而粪便DNA分析法受引物选择和测序方法的影响很大。

发明内容

本发明公开一种利用鸳鸯粪便分析鸳鸯食性的方法，该方法采用非损伤采样技术进行采样，采用OmegaSoil DNA Kit提取总DNA，选定叶绿体 ribulosebisphosphate carboxylase大亚基基因(rbcL基因)；进行PCR扩增后送测序，再进行生物信息的处理与分析，从而得到鸳鸯粪便中的植物种类，具体包括以下步骤：

(1)采样：利用观察法，在野外采集鸳鸯的新鲜粪便。

(2)总DNA提取、PCR扩增：提取粪便中所有DNA，采用DNA聚合酶对 rRNA基因可变区或特定基因片段进行PCR扩增，扩增引物为叶绿体rbcL基因，其中，前引物为Z1aF：5'-ATGTCACCACCAACAGAGACTAAAGC-3'，后引物为hp2R： 5'-CGTCCTTTGTAACGATCAAG-3'，对扩增产物进行回收、纯化、荧光定量，然后制备测序文库。

(4)进行生物信息的处理：识别并剔除测序文库中的疑问序列，利用FLASH 软件对序列配对连接及去除嵌合体，以97％的非重复序列相似度作为阈值聚类 OTU，将丰度值低于样本测序总量0.001％的OTU去除，得到处理后的序列及OTU。

(5)采用NCBI BLAST数据库对OTU进行分类及鉴定，未能归类到已知分类单元的OTU代表序列，划入“Unclassified”，采用NCBI数据库对所获序列进行比对，得出植物物种鉴定结果。

(6)随机抽取样本的序列数及OTUs绘制稀疏曲线，以检验测序深度是否合理、在测序深度合理的情况下，分析各样本在门、纲、目、科、属、种分类水平上的组成及其丰度，从而得到鸳鸯粪便中的植物种类及分析出取食偏好。

本发明步骤(1)中采样过程中，待鸳鸯种群取食或上岸休息30～40分钟后，及时到达鸳鸯活动点，寻找到新鲜粪便，在8:00-9:00、13:00-14:00和 18:00-19:00这三个鸳鸯活动频繁的时间段采样。