[发明专利]一种检测SARS-COV-2的双链引物探针、试剂盒及多重PCR方法

说明书

本发明属于PCR技术领域，具体公开了一种检测SARS‑COV‑2的双链引物探针、试剂盒及多重PCR方法。所述双链引物探针包括用于检测SARS‑COV‑2病毒的ORF1ab、N和E基因序列的特异性引物探针，所述试剂盒包括所述双链引物探针。本发明采用双链引物探针来减少引物自身形成茎环结构或引物之间形成二聚体的机率，使得PCR扩增效率达到一致，从而解决了多重PCR之间的竞争性抑制，实现了SARS‑COV‑2病毒ORF1ab、N和E多个靶基因的单管同时检测。本发明的双链引物探针实现了引物和探针的一体化设计，减少了体系的复杂程度，提升了引物和模板结合的特异性；且所述双链引物探针温度兼容性好，且便于新用户操作。

技术领域

本发明涉及PCR技术领域，特别是涉及一种检测SARS-COV-2的双链引物探针、试剂盒及多重PCR方法。

背景技术

实验室检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)的方式包括病毒分离培养、血清学检测和分子生物学检测等。目前市场上新型冠状病毒检测以分子生物学检测为主，由于荧光定量PCR法检测具有操作简便快速、准确度高、可用于早期确诊等特点，因此是目前已经应用的新型冠状病毒检测试剂盒的主要实验原理。荧光定量PCR和普通PCR反应相同，都需要根据目标序列设计扩增引物，然后在扩增过程中，通过荧光信号对PCR进程进行实时监控；其检测方法包括双链DNA交联荧光染料、Taqman探针法、分子信标法和双杂交探针等。

对于一种新型病毒来说，其鉴定依赖于该病毒RNA序列上的高度保守的序列，即使病毒再次发生变异，这些高度保守的序列在进化中基本保持不变。在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所1月21日发布的新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列一文中，说明了试剂盒的目标序列分别为新冠病毒的开放读码框1ab(open reading frame，ORF1ab)、核壳蛋白(nucleoprotein，N)基因区域。除了这两个目标基因外，上海之江生物生产的试剂盒还包含新冠病毒的囊膜糖蛋白基因(envelope gene，E基因)，可以通过三重荧光PCR的方法更准确地对新冠病毒感染者进行判断。

多重荧光定量PCR是在单个PCR反应管中同时进行多个反应，从而一次性扩增多个靶基因，可节省大量的时间和经费，具有巨大的时效性和经济性，是广泛应用的分子生物学技术。引物设计是多重PCR成功与否的关键，但引物设计并不是单重反应引物设计的简单叠加：一方面，引物之间以及引物与模板序列之间的相互干扰，导致多重PCR引物设计考虑因素增加，极大地增加了计算的空间和时间复杂度；另一方面，多重PCR引物设计需要被当作一个整体考虑，不能被分割为多个PCR引物设计问题的简单组合。多重PCR的引物设计需要满足单重PCR引物的约束条件，亦要考虑引物之间的相互干扰，让退火温度同时适合多个引物与模板的结合，那就需要解决以下挑战：引物二聚体、引物发夹结构、引物脱靶效应和兼容多对引物的退火温度。

综上，本发明拟针对SARS-COV-2病毒的ORF1ab、N和E基因设计一种特异性更好、温度兼容性更好的适用于多重荧光定量PCR的引物探针。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测SARS-COV-2的双链引物探针、试剂盒及多重PCR方法，本发明通过设计双链引物探针，实现引物和探针的一体化设计，减少体系的复杂程度，并提升引物和模板结合的特异性，本发明通过设计多对引物探针并标记不同的荧光基团可应用于SARS-COV-2病毒的多个靶基因的多重PCR检测。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种检测SARS-COV-2的多重荧光定量PCR双链引物探针，所述双链引物探针包括用于检测SARS-COV-2病毒的ORF1ab、N和E基因序列的特异性引物探针，其中，针对ORF1ab基因序列的特异性引物探针序列如下：

上游双链引物探针的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，

下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示；