[发明专利]一种检测SARS-COV-2的双链引物探针、试剂盒及多重PCR方法

权利要求书

1.一种检测SARS-COV-2的多重荧光定量PCR双链引物探针，其特征在于，所述双链引物探针包括用于检测SARS-COV-2病毒的ORF1ab、N和E基因序列的特异性引物探针，其中，针对ORF1ab基因序列的特异性引物探针序列如下：

上游双链引物探针的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，

下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示；

针对N基因序列的特异性引物探针序列如下：

上游双链引物探针的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，

下游引物的序列如SEQ ID NO.6所示；

针对E基因序列的特异性引物探针序列如下：

上游双链引物探针的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，

下游引物的序列如SEQ ID NO.9所示。

2.根据权利要求1所述的双链引物探针，其特征在于：所述荧光探针的5’端均连接有荧光基团，所述荧光探针的3’端均连接有淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的双链引物探针，其特征在于：所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX中的任意一种，所述淬灭基团选自BHQ1、Dabcyl中的任意一种。

4.一种检测SARS-COV-2的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有如权利要求1-3任一项所述的双链引物探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述上游双链引物探针和下游引物的浓度均为10μM。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品为包含SARS-COV-2病毒ORF、E和N基因的质粒，阴性对照品为去离子水。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应体系为：去离子水5.5μL，PCR反应缓冲液12.5μL，DNA模板5μL，上游双链引物探针10uM、1μL，下游引物10μM、1μL；

和/或，所述试剂盒进行荧光定量PCR的扩增程序为：

逆转录，55℃，持续时间10min；

预变性，95℃，持续时间3min；

变性，95℃，持续时间15s，循环数50个；

退火，57℃，持续时间15s，循环数50个；

延伸，72℃，持续时间15s，循环数50个；

荧光收集，45℃，持续时间5s，循环数50个。

9.一种检测SARS-COV-2的双链引物探针多重荧光定量PCR方法，其特征在于：从样本中提取SARS-COV-2病毒，采用如权利要求4-8任一项所述的试剂盒，同时扩增SARS-COV-2病毒的ORF1ab、N和E基因，然后对扩增产物进行多重荧光定量PCR检测。

10.根据权利要求9所述的多重荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将如第二方面所述的试剂盒中的试剂混匀后瞬时离心，得到PCR反应液，将PCR反应液分装至PCR反应管中；

(2)将DNA模板加入PCR反应管中，将PCR反应液与DNA模板振荡混匀后瞬时离心，并记录DNA模板加样顺序；

(3)同时扩增SARS-COV-2病毒的ORF1ab、N和E基因，然后对扩增产物进行多重荧光定量PCR检测，收集荧光信号。