[发明专利]黄檗体细胞胚组织培养培养基及组织培养方法

说明书

本发明涉及植物组织培养技术领域，公开了一种黄檗体细胞胚诱导培养基和分化培养基，以及其对应的组织培养方法。本发明选择黄檗体细胞胚诱导关键期的半成熟合子胚为外植体，通过在培养基中添加水解酪蛋白对外植体进行组织诱导，获得黄檗胚性愈伤组织，诱导率高。且分化得到的愈伤组织可以继续保持胚性，能进一步分化，诱导植株再生。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种黄檗体细胞胚诱导培养基和分化培养基，以及其对应的组织培养方法。

背景技术

黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)是芸香科黄檗属植物，雌雄异株植物，为我国特有种，是东北三大珍贵硬阔叶用材树种之一，同时也是我国名贵中药关黄柏的药源植物。由于其具有药用和木材双重经济价值而被大量砍伐，导致资源量锐减，现已被列为国家一级珍贵树种、国家2级保护树种和易危物种。但是由于人工采挖和利用不当，其野生资源遭到严重破坏。

植物体细胞胚发生技术是植物快速繁殖最重要手段之一，可在较短的时间内获得大量的营养繁殖体，这对于保护和开发黄檗资源的利用潜力有重要意义。上世纪90年代到本世纪初，我国关于植物体细胞胚胎发生的研究对象以经济和粮食作物居多，木本植物研究较少。胚性细胞的诱导、增殖和分化培养，繁殖系数高，繁殖速率快，可以实现植物体细胞胚的工厂化生产。黄檗体细胞胚诱导技术在国内外尚属空白。黄檗组织培养，仅初步建立了黄檗叶片或茎段愈伤组织诱导，增殖培养，生根培养中生根率极低，繁殖系数低。

发明内容

本发明提供了一种黄檗体细胞胚诱导培养基和分化培养基，以及利用该培养基进行组织培养方法。本发明选择黄檗体细胞胚诱导关键期的半成熟合子胚为外植体，通过在培养基中添加水解酪蛋白对外植体进行组织诱导，获得黄檗胚性愈伤组织，诱导率高。且分化得到的愈伤组织可以继续保持胚性，能进一步分化，诱导植株再生。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种适用于黄檗体细胞胚诱导的诱导培养基，所述诱导培养基为：MS+2,4-D 2.0-3.0mg/L+6-BA1.0-2.0mg/L+水解酪蛋白800-1000mg/L。

其中，本发明的基本培养基为MS培养基。MS培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡，是较稳定的离子平衡溶液。MS培养基的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要。本发明中MS培养基的配制方法采用本领域中的常规方法进行配制即可。

本发明中诱导培养基中的生长素采用2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)。2,4-D对愈伤组织的诱导作用优于其它生长素，如IAA、NAA。本发明中，愈伤组织的诱导与激素含量有一定关系。本发明诱导培养基中，2,4-D的含量优选为2.0mg/L-2.8mg/L，更优选为2.0mg/L。

本发明中诱导培养基中的细胞分裂素为6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)，主要作用是促进细胞分裂，诱导愈伤组织发生。本发明诱导培养基中，6-BA的含量优选为1.2mg/L-1.8mg/L，更优选为1.4-1.6mg/L。

本发明中诱导培养基中还添加了水解酪蛋白。经实验证实，水解酪蛋白在黄檗体细胞胚诱导中作用最大，是黄檗胚培养的必需物质。本发明诱导培养基中，水解酪蛋白的含量优选为800mg/L-1000mg/L，更优选为800-900mg/L。

本发明还提供了上述诱导培养基诱导黄檗愈伤组织的方法，以黄檗半成熟合子胚为外植体，接种于上述诱导培养基中进行培养，得到黄檗愈伤组织。

本发明为黄檗体细胞胚诱导植株再生方法，外植体采用黄檗半成熟合子胚。本发明通过对黄檗不同发育期的合子胚，选择黄檗体细胞胚诱导关键期的半成熟合子胚为外植体，成功分化得到了黄檗的愈伤组织和原胚，诱导效率高。