[发明专利]环己烯甲酸酯水解酶及其突变体、编码基因、表达载体、重组菌与应用

说明书

本发明公开了一种环己烯甲酸酯水解酶及其突变体、编码基因、表达载体、重组菌与应用，本发明环己烯甲酸酯水解酶AcEst1及其突变体具有高效对映选择性拆分3‑环己烯‑1‑甲酸酯，制备光学活性(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸的功能。在底物浓度高达2000mM(约280g/L)时，产物的光学纯度高于99％，底物/催化剂高达3500g/g。相对于其它制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，光学纯度好，催化剂效率高，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及一种环己烯甲酸酯水解酶及其突变体、编码基因、表达载体、重组菌与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

(S)-3-环己烯-1-甲酸[(S)-3-cyclohexene-1-carboxylic acid，(S)-CHCA]，分子式：C₇H₁₀O₂，分子量：126.15，沸点：118℃/6mmHg(lit.)，CAS号为5708-19-0。

手性3-环己烯-1-甲酸是构建多种天然产物、手性药物和农用化学品的重要砌块单元，可用于合成许多天然产物和药物如新型免疫抑制剂他克莫司，抗肿瘤药(+)-Phyllanthocin，昆虫防治引诱剂(–)-哌拉平-B，神经氨酸酶抑制剂磷酸奥司他韦，和凝血因子Xa抑制剂依度沙班等，随着手性药物市场的不断扩大，手性环己烯-1-甲酸的需求迅速增加。3-环己烯-1-甲酸的不饱和六元环具有高度的对称性，手性碳两侧基团的差异非常小，实现其高对映选择性合成充满挑战。因此，建立高对映选择性的酶法合成手性3-环己烯-1-甲酸的工艺具有重要的应用价值。

目前手性3-环己烯-1-甲酸的合成方法主要有狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应，化学法外消旋酸拆分法和酶法不对称水解拆分3-环己烯-1-甲酸酯。其中Diels-Alder反应是目前合成手性3-环己烯-1-甲酸的主要方法，然而由于丁二烯为气体且产物为不易于分离，反应步骤繁琐，收率较低，仍然需要进一步改进(Synlett,1990,1,38–39.]。化学拆分过程需要在丙酮中进行至少六次重结晶才可分离出光学纯的对映异构体，导致丙酮的大量使用，拆分收率仅20～30％，原子经济性低(DrugsClinic,2013,28,126–128)。由此可见，化学法合成手性3-环己烯-1-甲酸面临操作繁琐、收率较低和丙酮的大量使用等诸多问题。生物催化法合成手性化合物具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好、操作简便等优势，使其成为可持续发展过程中替代或拓展传统化学合成的重要方法。