[发明专利]一种大鼠体内微核试验流式细胞术检测方法

说明书

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种大鼠体内微核试验流式细胞术检测方法，其包括以下步骤：步骤一：目标组织细胞采集，采集受试大鼠目标检测组织并制备单细胞悬液待测；步骤二：表面抗原染色，将待测样本与抗体应用液混合染色；步骤三：核酸染色，将完成步骤二的样本与核酸染料应用液混合染色；步骤四：结果检测，染色结束后，使用双激光流式细胞仪对样本进行检测以获取数据。该检测方法只需普通双激光流式细胞仪，并无需细胞破膜和消化RNA等步骤便可进行遗传毒性检测，可为食品/保健食品、药品、化妆品、农药等安全性评价提供一种更为高效简便、稳定性较高、节约成本的检测方法。

技术领域

本发明涉及毒理学安全性评价遗传毒性试验技术领域，具体涉及一种大 鼠体内微核试验流式细胞术检测方法。

背景技术

遗传毒性评价作为食品/保健食品、药品、化妆品、农药等安全性评价 的重要部分，与致癌性、致畸性密切相关，可为政府审批和上市相关化学物 和/或制定相关标准及进行监督/管理提供科学依据，对于确保食品/环境安 全、保护居民健康、防止相应危害的发生具有重要作用。微核试验用于检测 染色体断裂剂和非整倍体诱导剂，是一项经典的遗传毒性研究方法，人用药 品注册技术要求国际协调会议、我国卫生健康委员会等国际组织和国家管理 部门均将体内微核试验作为首选的体内遗传毒性试验之一。传统微核试验检 测方法为人工计数方法，然而随着毒理学检验要求的提高，微核人工检测方 法与待检任务、检测能力之间的矛盾越来越突出，评价机构和科研单位对微 核试验自动化检测的需求日益增加。

目前，已建微核试验流式细胞术检测方法主要有：4',6-二脒基-2-苯基 吲哚单染、Hoechst 33258单染、Hoechst 33342/噻唑橙双染等，这些方法 存在操作步骤繁琐、需要配备特定激光的流式细胞仪、重复性较差等缺陷， 限制了这些方法的应用。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种大鼠体内微核试验流 式细胞术检测方法，只需普通双激光流式细胞仪，并无需细胞破膜和消化RNA 等步骤便可进行遗传毒性检测。可为食品/保健食品、药品、化妆品、农药 等安全性评价提供一种更为高效简便、稳定性较高、节约成本的检测方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种大鼠体内微核试验流式 细胞术检测方法，其包括以下步骤：

步骤一：目标组织采集，采集受试大鼠目标检测组织并制备单细胞悬液 待测；所述目标检测组织为外周血或骨髓；目标检测组织为外周血时，加入 与外周血体积比为1:5的1000U/mL的肝素钠溶液混合均匀形成外周抗凝血； 若目标检测组织为骨髓时，收集骨髓时剪去股骨两端，使用注射器吸取胎牛 血清将骨髓冲洗出骨髓腔，以300g/min转速进行5分钟离心，弃上清，使 用PBS重悬；将采集后的外周抗凝血或骨髓作为待测样本置于4℃避光环境 保存待检。

步骤二：表面抗原染色，将待测样本与抗体应用液混合染色；外周抗凝 血作为待测样本时，采用双染方案进行染色，加入与待测样本体积比为5:1 的抗体应用液，混合均匀后置于4℃避光环境染色30分钟；其中，每100μ L抗体应用液中含2％胎牛血清和2μg CD71-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)。

外周血抗凝血或骨髓作为待测样本时，可采用三染方案进行染色，加入 与待测样本体积比为5:1的抗体应用液，混合均匀后置于4℃避光环境染色 30分钟；其中，每100μL抗体应用液中含2μg CD71-FITC、0.5μg CD45- 藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、2％胎牛血清。