[发明专利]一种大鼠体内微核试验流式细胞术检测方法

权利要求书

1.一种大鼠体内微核试验流式细胞术检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：

步骤一：目标组织采集，采集受试大鼠目标检测组织并制备单细胞悬液待测；所述目标检测组织为外周血或骨髓；目标检测组织为外周血时，加入与外周血体积比为1:5的1000U/mL的肝素钠溶液混合均匀形成外周抗凝血；若目标检测组织为骨髓时，收集骨髓时剪去股骨两端，使用注射器吸取胎牛血清将骨髓冲洗出骨髓腔，以300g/min转速进行5分钟离心，弃上清，使用PBS重悬；将采集后的外周抗凝血或骨髓作为待测样本置于4℃避光环境保存待检；

步骤二：表面抗原染色，将待测样本与抗体应用液混合染色；外周抗凝血作为待测样本时，采用双染方案进行染色，加入与待测样本体积比为5:1的抗体应用液，混合均匀后置于4℃避光环境染色30分钟；其中，每100μL抗体应用液中含2％胎牛血清和2μgCD71-FITC；

外周血抗凝血或骨髓作为待测样本时，可采用三染方案进行染色，加入与待测样本体积比为5:1的抗体应用液，混合均匀后置于4℃避光环境染色30分钟；其中，每100μL抗体应用液中含2μgCD71-FITC、0.5μg CD45-PE、2％胎牛血清；

步骤三：核酸染色，将完成步骤二的样本与核酸染料应用液混合染色；表面抗原染色结束后，使用PBS离心5分钟清洗一次，转速300g/min，弃上清，收集底层细胞，使用核酸染料应用液就均匀染色，并于37℃避光孵育30分钟，孵育后使用PBS并以300g/min离心5分钟清洗一次，弃上清，使用PBS重悬，再将样本转移至流式细胞管中，于4℃避光保存待检；其中，所述核酸染料应用液为含20μmol/LDRAQ5的PBS；

步骤四：结果检测，染色结束后，使用双激光流式细胞仪对样本进行检测以获取数据；若所述步骤二中使用双染方案进行染色，则流式细胞仪具体射门步骤为：a1、使用FSC、SSC确定红细胞群，排除血小板、细胞碎片、粘连；b1、使用APC通道信号设门排除有核细胞干扰，限定微核范围；c1、使用APC通道以获取DRAQ5荧光信号，代表DNA含量，和FITC通道标记CD71以确定不同细胞群；

若所述步骤二中使用三染方案进行染色，则流式细胞仪具体设门步骤为：a2、使用FSC、SSC确定红细胞群，排除血小板、细胞碎片、粘连；b2、使用PE通道信号排除白细胞干扰；c2、使用APC通道信号设门排除有核细胞干扰，限定微核范围；d2、使用APC通道以获取DRAQ5荧光信号，代表DNA含量，和FITC通道标记CD71以确定不同细胞群；

经设门后，DRAQ5+/FITC+为含微核的网织红细胞群，DRAQ5-/FITC+为不含微核的网织红细胞群，FITC-为成熟红细胞群；试验分析指标为网织红细胞微核率和网织红细胞比例；具体计算公式为：网织红细胞微核率‰＝含微核的网织红细胞/总网织红细胞×1000，网织红细胞比例％＝总网织红细胞/总红细胞×100；每样本至少检测20000个网织红细胞。

2.根据权利要求1所述的一种大鼠体内微核试验流式细胞术检测方法，其特征在于，所述步骤二中的待测样本至少为10μL。

3.根据权利要求2所述的一种大鼠体内微核试验流式细胞术检测方法，其特征在于，所述双激光流式细胞仪为具有488nm和633nm激光器的流式细胞仪。