[发明专利]耐热的I型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了耐热的I型普鲁兰酶的突变体酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1，或如SEQ ID No.2，或SEQ ID No.3，或SEQ ID No.4、或SEQ ID No.5所示。本发明还公开了编码突变体酶的基因，其如SEQ ID No.6，或SEQ ID No.7，或SEQ ID No.8，或SEQ ID No.9、或SEQ ID No.10。本发明还公开了突变体酶的制备方法，包括从普鲁兰酶的氨基酸序列选取突变位点，设计突变引物对；以携带普鲁兰酶基因的载体为模板，进行点突变反应，得到突变质粒；然后于转化工程菌中复制表达。本发明的突变体酶具有更优的耐热性能。

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程技术领域。更具体地说，本发明涉及一种耐热的I型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用。

背景技术

目前已经有很多普鲁兰酶被挖掘出来，甚至普鲁兰酶已经在基因层面进行了研究。但是真正能应用于工业生产中的却很少，目前商业化程度最高的是来源于Bacillusacidopullulyticus的普鲁兰酶。普鲁兰酶最主要的应用方式是用于淀粉的糖化过程，其工业应用条件为pH4.5～5.5，温度55～65℃甚至更高，持续作用时间长达48～60h(NISHA andSATYANARAYANA,2016)。大多数已报道的I型普鲁兰酶均无法适应这一工业条件，有些酶耐热性差，有些酶在pH5.5或更低的条件下酶活很低，甚至会失活。即使是商业化的B.acidopullulyticus普鲁兰酶也存在明显短板，其在60℃时的半衰期仅有34.9min，没有足够强的耐热性。

针对以上现状，本发明以普鲁兰酶的耐热性作为首要考虑因素，拟挖掘具有较强耐热性的普鲁兰酶。耐热普鲁兰酶的微生物来源多是嗜热或极端嗜热微生物，其生长条件恶劣，培养条件苛刻，不利于取样和筛选。因此，采用基因工程技术方式得到耐热性好的普鲁兰酶是值得尝试的。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种耐热的I型普鲁兰酶的突变体酶，以及耐热的I型普鲁兰酶的突变体酶的制备方法，得到的突变体酶具有优良的耐热性能。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种耐热的I型普鲁兰酶的突变体酶，所述突变体酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或如SEQ ID No.2所示，或如SEQ ID No.3所示，或如SEQ ID No.4所示、或如SEQ ID No.5所示。

提供了一种编码所述突变体酶的基因，编码所述突变体酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，或如SEQ ID No.7所示，或如SEQ ID No.8所示，或如SEQ ID No.9所示，或如SEQ ID No.10所示。

提供一种包含编码上述突变体酶的基因的工程菌。

提供一种包含编码上述的突变体酶的基因的载体。

提供了一种制备所述突变体酶的方法，包括以下步骤：

步骤一、根据NCBI数据库中公开的I型普鲁兰酶的氨基酸序列，进行同源建模，基于序列比对分析和蛋白结构分析，选取距离I型普鲁兰酶的催化位点10埃以内的氨基酸残基作为对象，通过序列比对排除掉其中非常保守的氨基酸残基，选取5个非保守氨基酸突变位点，对5个突变位点设计对应的突变引物对，所述突变引物对分别为

5′-CGGCGTGGGCAATGTTATCGCGACCGAACGT-3′和

5′-GATAACATTGCCCACGCCGCTTTCATTCAGATACG-3′、

5′-CGTGGGCAATGTTATGGCGAGCGAACGTCCGAT-3′和

5′-CTCGCCATAACATTGCCCACGCCGCTTTCATTC-3′、