[发明专利]制备视网膜色素变性非人哺乳动物模型的方法

说明书

本发明涉及一种制备视网膜色素变性非人哺乳动物模型的方法。该方法包括将所述动物同源染色体中一条上的内源性ctsd基因替换为h‑CTSD*基因；所述h‑CTSD*基因为发生c.262dupC位点变异的人源ctsd基因。本申请首次发现h‑CTSD*基因与RP相关，并建立了h‑CTSD*基因敲入的小鼠动物模型。本发明为研究CTSD突变与视网膜色素变性的关系及其致病机理提供了便捷、可靠、经济的手段，为其研究提供了可靠的理论依据。更为重要的是，该动物除RP外并不表现出痉挛、神经元蜡样脂褐质沉积、共济失调等神经性疾病症状，病理学背景更单纯，非常适合于作为RP动物模型的构建。

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医学技术领域，具体而言，涉及一种制备视网膜色素变性非人哺乳动物模型的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9技术是近几年发展起来的一种新基因编辑技术，由古细菌和细菌在长期选择性压力中形成的适应性免疫防御发展而来，可以有效抵御外源DNA的入侵。该免疫系统由Cas9蛋白、CRISPR RNAs(crRNAs)和trans-activating crRNAs(tracrRNA)三个组分组成，在免疫防御的过程中，向导crRNA指引Cas9蛋白靶向到外源基因并进行剪切。据此，人们在体外对crRNA-tracrRNA进行改造，得到一段可以识别NGG PAM(protosp aceradjacentmotif)序列和目的基因的sgRNA，同时可以与Cas9蛋白结合，指导其在PAM上游3～8bp处进行切割，形成DSB(double strand break)。DSB可以通过两种途径被修复，一种是非同源重组的末端接合(Non-Homologous End Joining，NHEJ)方式，另一种是同源重组修复(Homology Directed Repair，HDR)方式，后者需要导入同源片段作为修复模板。NHEJ修复方式可能产生碱基的插入或缺失，也可能突变成终止密码子，从而影响目的基因的表达。

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一组由多种发病机制引起的、主要累及光感受器和色素上皮的进行性视网膜变性疾病。视网膜色素变性是最常见的遗传性视网膜营养不良，人群中发病率约l/3500～1/7500。RP具有高度的遗传异质性，已发现至少有87个基因可以导致RP(参考RetNet网站：http://sph.uth.edu/retnet/)。这些基因的突变可分别导致常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或X连锁遗传RP。

组织蛋白酶D(cathepsin D，CTSD)是Westley等于1979年发现的一种天冬氨酸类溶酶体肽链内切酶，CTSD基因(Gene ID:1509)位于11p15.5，还有9个外显子。其正常功能是在溶酶体的酸性环境中水解蛋白质。在pH2.8～5.0的范围内，CTSD(最适pH值为4)能够降解激素、多肽前体、多肽、结构及功能蛋白质。CTSD基因敲除小鼠出生后26天(P26)死亡，并伴有眼盲、痉挛和神经元蜡样脂褐质沉积(Neuronal ceroid lipofuscinoses，NCL)。目前，已有报道CTSD基因错义突变(常染色体隐性突变)会引起NCL，并且CTSD还参与了其他几种疾病的发病机制，包括乳腺癌和阿尔茨海默病。

基于CTSD的上述特性，现有技术中有诸多对其突变位点的研究，部分研究结果整理如下：

可见，虽然现有技术中已有CTSD的部分突变会导致RP的相关报道，但其常常还伴随着多种神经系统症状，例如NCL、共济失调、认知能力衰退等问题，其病理学背景复杂，因而具有上述突变的动物很难用于RP机制研究或相关药物的筛选研究。

发明内容

本发明涉及一种制备视网膜色素变性非人哺乳动物模型的方法，包括：

将所述动物同源染色体中一条上的内源性ctsd基因替换为h-CTSD*基因；

所述h-CTSD*基因为发生c.262dupC位点变异的人源ctsd基因。