[发明专利]一种环形RNA全长鉴定方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及分子生物学领域，涉及一种环形RNA全长鉴定方法及其试剂盒，包括以下步骤：S1.Splice junction序列分析和环形RNA全长序列的对比预测；S2.设计CD Primers和Sjod Primers；S3.LS逆转录反应：取0.1～1μg抽提的总RNA加入N6 Random Primer，RNase‑Free H₂O混合得反应液I；然后向反应液I中加入5x LS RT Buffer，将LS Enzyme Mix加入反应液I中，得到cDNA；S4.PCR扩增和PCR产物分析；S5.Sanger测序和交叉分析对比序列。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种环形RNA全长鉴定方法及其试剂盒。

背景技术

环形RNA(circular RNAs,环形RNAs)是一类具有闭合环状结构的RNA分子，在多物种中广泛存在，比线性RNA更稳定。

目前研究多使用circBase等数据库及自有样品的高通量测序获得环形RNA信息，并筛选得到待研究的环形RNA后进行PCR检测、cDNA/gDNA分别扩增验证和RNase R消化等实验验证和确认其真实存在。但这些验证都是基于环形RNA的环化位点接头(Splicejunction)序列进行的，缺乏对环化位点内部真实全长序列的鉴定验证，因此极易导致检测的真实准确性失真，特别是对于序列内部有多个外显子且存在可变剪切的情况。例如(Yibing Yang et al..Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing GliomaTumorigenesis.J Natl Cancer Inst.2018 Mar 1；110(3))中通过PCR扩增和Sanger测序确定FBXW7的exon3和exon4经反向剪切形成620nt的环形RNA，而不是circBase数据库里收录hsa_circ_0001451的1227nt，可见不对环形RNA真实全长序列进行鉴定时极易导致基因识别错误、检测和验证失真。

使用circBase等数据库及自有样品的高通量测序获得环形RNA信息中参考序列的注释也局限于技术本身和分析方法。1)高通量测序的reads长度在150nt左右，不能测到环形RNA的真实全长序列。2)环形RNA Junction reads的筛选鉴定和注释是mapping到参考基因组与GenBank数据集中分析的，仅通过已知线性基因的对比分析确定环形RNA全长的参考序列，且以对比匹配最高的转录本作为环形RNA的全长序列，无法区别鉴定外显子的可变剪切和线性基因与环形RNA可能不同的外显子组合。3)来自两条或更多pre-mRNA的剪切会因反式剪切(trans-splicing)形成tsRNA(trans-spliced RNA)，这类tsRNA可能和环形RNA有相同的Splice Junction序列，导致环形RNA的筛选识别出现假阳性。

因此急需开发一种环形RNA全长鉴定方法，对circBase已收录或新发现的环形RNA都进行全长鉴定以确定其真实的全长序列。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的第一在于提供一种环形RNA全长鉴定方法，解决了环形RNA鉴定验证和研究中容易出现的识别错误、检测和验证失真等问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种环形RNA全长鉴定方法，包括以下步骤：

S1.Splice junction序列分析和环形RNA全长序列的对比预测：首先在UCSCgenome blast中对比，确认Splice junction序列对应的AG-GT剪切位点，然后在UCSCgenome browser中对比，获得对应的基因组DNA序列，并在Ensembl中对比，获得预测的转录环形RNA全长序列；