[发明专利]一种环形RNA全长鉴定方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种环形RNA全长鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.Splice junction序列分析和环形RNA全长序列的对比预测：首先在UCSC genomeblast中对比，确认Splice junction序列对应的AG-GT剪切位点，然后在UCSC genomebrowser中对比，获得对应的基因组DNA序列，并在Ensembl中对比，获得预测的转录环形RNA全长序列；

S2.设计CD Primers和Sjod Primers：使用软件设计引物在已知序列中搜索得到40bp的引物可选区，从数据库中获得环形RNA的序列和Splice junction序列，选用21~40bp作为正向引物，将1~20bp的序列反向互补后作为反向引物得CD Primers；将Splice junction位置的上游20bp和下游10bp共30bp序列输入引物设计软件中，搜索计算以使引物符合GC含量、Tm值常规的参数要求，从而得到Sjod的上游引物，所述Sjod的上游引物包含上述Splicejunction位置的不少于上游13bp和不多于下游7bp的序列，接着根据上游引物的参数和位置使用软件自动设计得到一条Sjod下游引物，获得Sjod Primers；

S3.LS逆转录反应：抽提样品中的总RNA，取0.1～1μg抽提的总RNA加入N6 RandomPrimer，RNase-Free H₂O混合，在温度为60～70℃反应5～10min，迅速冰浴2～3min，得反应液I；然后向反应液I中加入5x LS RT Buffer，将LS Enzyme Mix加入反应液I中，在温度为20～30℃条件下反应5～10min，升温至50～60℃条件下反应60～65min，再升温至80～90℃条件下反应5～10min得到cDNA；所述LS Enzyme Mix包括逆转录酶LS M-MLV和RNaseInhibitor，所述逆转录酶LS M-MLV基因序列如SEQ ID NO.1；所述逆转录酶LS M-MLV删除了RNase H结构域；所述逆转录酶LS M-MLV突变体为△N23/D108R/T306L/V433K/△aa524-551；

S4.PCR扩增和PCR产物分析：使用步骤S2得到的CD Primers、Sjod Primers和步骤S3得到的cDNA进行扩增，得PCR产物，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，得直接扩增条带和滚环产物条带；

S5.Sanger测序和交叉分析对比序列:将步骤S4取得的直接扩增条带回收后直接进行Sanger测序，滚环产物条带回收后连接至pMD19T载体中进行Sanger测序；交叉对比CDPrimers或Sjod Primers的直接扩增条带序列与滚环产物条带序列，所述直接扩增条带序列确认和验证Splice junction位置的序列，所述滚环产物条带序列中两个Splicejunction位点之间为环形RNA的真实全长序列。

2.根据权利要求1所述的环形RNA全长鉴定方法，其特征在于，所述步骤S3中逆转录中反应液I的组成包括：

实验材料体积

总RNA 0.1~1μg

N6 Random Primer 0.5μL

RNase-Free H₂O Up to 14 μL

所述步骤S3中LS逆转录中cDNA的组成包括：

实验材料体积

反应液I 14μL

LS Enzyme Mix 2μL

5× LS RT Buffer 4μL。

3.根据权利要求1所述的环形RNA全长鉴定方法，其特征在于，所述步骤S3中取0.1～1μg抽提的总RNA加入N6 Random Primer，RNase-Free H₂O混合，在温度为65℃反应5min，迅速冰浴2min，得反应液I。

4.根据权利要求1所述的环形RNA全长鉴定方法，其特征在于，所述步骤S3中将LSEnzyme Mix加入反应液I中，在温度为25℃条件下反应5min，升温至55℃条件下反应60min，再升温至85℃条件下反应5min得到cDNA。