[发明专利]一种环形RNA检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及分子生物学领域，涉及一种环形RNA检测方法及试剂盒，环形RNA检测方法，包括以下步骤：S1.引物设计；S2.逆转录反应：取0.1～1μg抽提的总RNA加入N6 Random Primer，RNase‑Free H₂O混合得反应液I；然后向反应液I中加入5×HT RT Buffer，将HT M‑MLV Mix加入反应液I中，最后加入RNase‑Free H₂O得到cDNA；S3.HS PCR扩增：使用步骤S1得到的FSjod Primers、2×SNP Taq Mix、50×ROX Mix*、RNase‑Free H₂O和步骤S2得到的cDNA进行qPCR检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种环形RNA检测方法及试剂盒。

背景技术

环形RNA(circular RNAs,环形RNAs)是一类具有闭合环状结构的RNA分子，在多物种中广泛存在，比线性RNA更稳定。环形RNA可以miRNA sponge、与聚合酶II(RNApolymerase II，Pol II)相互作用调控宿主转录活性、直接翻译蛋白质等多种功能途径在脑发育、帕金森、阿尔兹海默病和肿瘤发生中发挥重要作用，有望作为疾病诊断标志物或治疗靶标。因此可靠的环形RNA定量检测方法至关重要。

目前对环形RNA的定量检测有RT-PCR、RT-qPCR、Taqman qPCR、ddPCR和Northernblot等方法，其中RT-qPCR是保证特异性和灵敏度时使用最广泛，检测最简便经济的方法。Taqman qPCR法在临床检测中应用最广泛，但检测成本较高。而RT-qPCR和Taqman qPCR都基于PCR扩增，区别在于信号的检测方式和灵敏度的差异。

具体对于环形RNA来讲，PCR扩增的特异性、准确性和灵敏性都受很大限制。

一个限制因素是环形RNA与对应的线性RNA (mRNA)碱基序列完全相同，仅在环化剪切位点(Splice junction)处有特异性，能与线性RNA区分开。因此特异检测环形RNA常设计反向引物(Divergent primers)，但引物设计难度大，容易扩增含相同序列的其他环形RNA，特别是在序列末端多或少一个或多个外显子的其他环形RNA，即反向引物对检测环形RNA的特异性有限。同时由于引物位置偏差，可能会非特异扩增到线性RNA。另外来自两条或更多pre-mRNA的剪切会因反式剪切形成tsRNA (trans-spliced RNA)，这类tsRNA可能和环形RNA有相同的Splice junction序列，干扰环形RNA检测的特异性和准确性。

另一个限制因素是逆转录过程，常用的逆转录酶(如M-MLV(H-))有很强的模板置换活性，RNase H活性缺失使RNA模板不会消化，因此逆转录酶与环形RNA模板链紧密结合，形成滚环逆转录的cDNA产物，即一条cDNA链中有多个Splice junction相连接。导致特异检测环形RNA的模板数量被放大，PCR扩增时会扩增到滚环条带或多条带，导致丰度和相对含量失真，定量检测结果出现较大偏差。

使用RNase R消化去除线性RNA并富集环形RNA，可以减少对环形RNA特异性检测的干扰。但总RNA经RNase R消化后，线性和环形RNA的丰度和相对比例都发生变化，且部分环形RNA也会被消化降解，因此导致环形RNA定量检测失真，所以RNase R不适用于环形RNA的准确定量检测。