[发明专利]一种环形RNA检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种环形RNA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.引物设计：从数据库中获得circRNA的序列和Splice junction序列，将Splicejunction位置的上游20bp和下游10bp共30bp序列输入引物设计软件中，搜索计算以使引物符合GC含量、Tm值常规的参数要求，并使包含不少于上游13bp和不多于下游7bp的序列，即跨越环化位点1~7个碱基，从而得到FSjod的上游引物，接着根据上游引物的参数和位置使用软件自动设计得到一条FSjod下游引物，获得FSjod Primers；

S2.逆转录反应：抽提样品中的总RNA，取0.1～1μg抽提的总RNA加入N6 RandomPrimer，RNase-Free H₂O混合，在温度为60～70℃反应5～10min，迅速冰浴2～3min，得反应液I；然后向反应液I中加入5×HT RT Buffer，将HT M-MLV Mix加入反应液I中，在温度为20～30℃条件下反应5～10min，升温至50～60℃条件下反应15～20min，再升温至80～90℃条件下反应5～10min，最后加入RNase-Free H₂O得到cDNA，-20℃保存备用；

S3.HS PCR扩增：使用步骤S1得到的FSjod Primers、2×SNP Taq Mix、50×ROX Mix^*、RNase-Free H₂O和步骤S2得到的cDNA进行qPCR检测，PCR扩增结束后，按照2^-△△Ct法计算环形RNA的表达量；所述HT M-MLV Mix包含逆转录酶HT M-MLV RNase H⁺和RNase Inhibitor，所述逆转录酶HT M-MLV RNase H⁺的突变型为A32V/E69K/L72R/E286R/E302R/T306L/W313F/W388R /L435R/N454K，所述逆转录酶HT M-MLV RNase H⁺氨基酸序列如SEQ IDNO.1；

所述2×SNP Taq Mix包括SNP Taq、dNTP和Mg²⁺，SNP Taq的突变型为V155A/ G418K/N483Q/S486Q/T539N/W604R/R660V/F667Y/M747R，所述SNP Taq氨基酸序列如SEQ ID NO.2；

所述步骤S2中逆转录中反应液I的组成包括：

实验材料体积

总RNA up to 12μL0.1~1 μg

N6 Random Primer 2μL

RNase-Free H₂O Up to 14 μL

所述步骤S2中逆转录中cDNA的组成包括：

实验材料体积

反应液I 14μL

HT M-MLV Mix 2μL

5× HT RT Buffer 4μL。

2.根据权利要求1所述的一种环形RNA检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系组成为：

实验材料体积

2×SNP Taq Mix 12.5μL

cDNA 2μL

Primer-F10μM 0.4 μL

Primer-R10μM 0.4 μL

50× ROX Mix* 0.4μL

RNase-Free H₂O 9.3μL

PCR反应条件为：1）预变性：95℃ 5 min；2）循环反应：40循环95℃ 10 s, 60℃ Xs；3）熔解曲线：95℃ 1 min，55℃ 1 min，55℃~98℃10s/cycle,0.5℃/cycle，其中50×ROX Mix需根据仪器选用。