[发明专利]一种提高猪繁殖与呼吸综合征病毒体外培养感染量的方法及其应用

说明书

本发明涉及提供一种提高猪繁殖与呼吸综合征病毒体外培养感染量的方法及其应用，在MARC‑145细胞或PAMs体外培养PRRSV过程中添加胰蛋白酶或弹性蛋白酶，所述胰蛋白酶的浓度为100μg/mL～200μg/mL；弹性蛋白酶的浓度为0.5mg/mL～1mg/mL。与未加蛋白酶和添加其他蛋白酶处理组相比，添加有胰蛋白酶或弹性蛋白酶处理组PRRSV RNA含量、蛋白表达和病毒滴度明显升高。本发明提供的PRRSV感染细胞信息丰富了PRRSV增殖机制，为后续研究PRRSV致病机理提供了参考，本发明提供的方法可应用于PRRS疫苗生产。

技术领域

本发明涉及一种提高猪繁殖与呼吸综合征病毒体外培养感染量的方法及其应用，属于病毒学和细胞生物学领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus，PRRSV)感染引起的，以妊娠母猪发生严重繁殖障碍以及各年龄阶段猪发生呼吸系统疾病为主要特征的病毒性传染病。该病于1987年最早发生在美国，此后相继在各主要养猪国家发生，现已呈世界性分布。PRRS对全球尤其是我国养猪业危害巨大，严重制约了生猪产业健康发展。PRRSV是具有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Porartevirus)。2006年，我国大面积爆发和流行了由高致病性PRRSV(highly pathogenicPRRSV，HP-PRRSV)引起的“高热综合征”，对国内养猪业造成了前所未有的打击。

目前，PRRS尚无特效药，免疫接种是主要的防治措施，目前商品化PRRS疫苗仍是传统的弱毒疫苗和灭活疫苗。就疫苗本身而言，高滴度的病毒是疫苗产生良好免疫效果的前提，而体外培养却难以获得高滴度的PRRSV，如靠大量培养，再通过浓缩的方法获得高滴度的PRRSV，不仅费时费力，而且成本较高。因此，如何在体外培养获得高滴度的PRRSV，已成为制约PRRS疫苗生产的瓶颈。猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)、非洲绿猴肾上皮细胞MARC-145等可对PRRSV进行体外培养，用于病毒灭活疫苗和弱毒疫苗生产。因此，为提高PRRSV体外培养感染量进行疫苗生产，仍需进一步探索、优化病毒体外培养方法。

发明内容

针对现有方法的不足，本发明的目的是提供一种提高PRRSV体外培养感染量的方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种提高猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV体外培养感染量的方法，在MARC-145细胞或PAMs体外培养PRRSV过程中添加胰蛋白酶或弹性蛋白酶。

所述胰蛋白酶的浓度为100μg/mL～200μg/mL；弹性蛋白酶的浓度为0.5mg/mL～1mg/mL。

所述提高PRRSV体外培养感染量的方法，具体步骤为：

(1)将MARC-145细胞按5×10⁴个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μL的DMEM培养基，于37℃CO₂培养箱中培养12h；

(2)更换新的DMEM培养基，以病毒感染复数为1的高致病性PRRSVHN07-1毒株于4℃孵育MARC-145细胞1h；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，洗去未结合细胞的病毒粒子；

(3)向细胞培养板孔中分别加入无细胞毒性的胰蛋白酶或弹性蛋白酶，室温处理15min；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，向细胞培养板孔中加入500μL的DMEM培养基，37℃培养12h或48h。

所述提高PRRSV体外培养感染量的方法，具体步骤为：