[发明专利]核酸内切酶SpCas9的高PAM兼容性截短型变异体txCas9及其应用

说明书

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体为一种来源于酿脓链球菌的CRISPR核酸酶SpCas9的高PAM兼容性截短型变异体txCas9及其应用。本发明中的高PAM兼容性截短型变异体txCas9核酸酶属于CRISPR‑Cas9系统。txCas9核酸酶是将高PAM兼容性xCas9核酸酶的第180位到299位的氨基酸截掉后重组所得。该高PAM兼容性截短型变异体txCas9不仅具有与野生型CRISPR‑Cas9核酸酶相当的基因编辑活性，而且能够识别NGN、GAA、GAT PAM，有效扩宽了CRISPR‑Cas9核酸酶的靶向范围。重要的是，该小型化Cas9核酸酶适合使用装载容量有限的腺病毒载体进行体内运输，因而在生物医药的体内精准编辑方面具有更大的应用潜力。

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及来源于酿脓链球菌的CRISPR-Cas9核酸酶SpCas9的高PAM兼容性截短型变异体txCas9及其应用。

背景技术

CRISPR-Cas9是细菌和古细菌中抵抗外源核酸的免疫系统，目前已发展为一种特异性切割DNA片段的基因编辑技术(1)。其中，来源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的SpCas9，因其具有构建简单、可操作性强、效率高等特点，目前已成为应用最为广泛的CRISPR核酸酶(2)。近年来，该系统已被广泛应用于基因工程领域，比如，利用CRISPR系统进行基因干扰，从而阐明基因功能(3)；通过设计靶向致病基因位点的引导RNA，快速建立细胞或动物疾病模型(4)；将失活的Cas9(dCas9)与增强子或沉默子融合，使基因转录上调或沉默(5)。值得一提的是，dCas9与碱基修饰酶融合后形成的碱基编辑系统使CRISPR-Cas9进入了精准基因组编辑时代，该系统利用脱氨酶对靶位点上的嘌呤或嘧啶进行脱氨反应，实现精准的碱基替换，最终使导致约2/3人类疾病发生的单核苷酸变异得到修复(6)。

虽然SpCas9是一个强大的基因编辑工具，但仍存在着许多有待解决的问题。比如SpCas9体积过于庞大，其4.2kb的大小对于常用的装载容量只有4.5kb的腺病毒载体而言包装困难，因此难以通过病毒载体将其高效靶向地运载到体内或细胞中，从而限制了其在临床医学治疗上的应用(7)；当sgRNA引导SpCas9至特定靶序列时，sgRNA可能会与其他类似靶序列的基因位点发生错误匹配，从而激活Cas9切割非靶DNA，导致脱靶效应(8)；SpCas9需要位于靶位点上游的NGG前间隔序列邻近基序(protospace adjacent motif，PAM)才能进行靶标识别，因此限制了其可靶向的基因组位点(9)。

为解决以上问题，人们通过定向进化、同源替换和结构指导等方法设计了一系列SpCas9突变体。其中，Johnny等通过定向进化的方法获得的xCas9，不仅具有与SpCas9相当的编辑活性，而且还具有PAM兼容性更高、脱靶率更低等特点，因此成为目前应用最多的SpCas9突变体之一(10)。虽然，xCas9已成功改善SpCas9存在的两个不足，但是其体积庞大的问题仍有待解决。因此，基于上述研究问题，在xCas9基础上获得小型化Cas9核酸酶，对有效实现体内基因位点的精准编辑是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种小型化、且具有高特异性的来源于酿脓链球菌的CRISPR-Cas9核酸酶SpCas9的高PAM兼容性截短型变异体txCas9及其应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供的来源于酿脓链球菌的CRISPR-Cas9核酸酶SpCas9的高PAM兼容性截短型变异体，其体积比xCas9小，具体是将xCas9第180位到299位氨基酸截掉所得，记为txCas9；属于CRISPR-Cas9系统。

在同等反应条件下，所述txCas9核酸酶与野生型SpCas9核酸酶具有同等的剪切活性。

在同等反应条件下，所述txCas9核酸酶比野生型SpCas9核酸酶的靶向范围更广。