[发明专利]一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用

说明书

本发明属于抗生素的微生物检测技术领域，尤其涉及一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用。该研究结果为TTC法的推广应用提供了一株方便易得的指示菌。该菌为革兰氏阳性菌，具体为地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌可替代嗜热链球菌进行TTC法试验，取得与嗜热链球菌同样或更为准确的结果。在37℃，乳样中含菌量为0.1mg/mL时，培养0.5h，加TTC溶液继续培养30min后，每10min观察一次结果，至阴性对照变红。

技术领域

本发明属于抗生素的微生物检测技术领域，尤其涉及一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用。

背景技术

抗生素是一类由微生物和其他的生物在生命活动过程中合成的代谢产物或其衍生物，其在很低的浓度时就能够抑制或干扰病原菌、病毒等的生命活动，如青霉素、四环素、金霉素、链霉素、氯霉素、磺胺类药物等。在医学上，抗生素被广泛的应用于预防和治疗多种微生物感染性疾病以及某些癌症。在奶业的源头中，抗生素使用频率很高，特别是治疗牛乳房炎，常常大剂量反复使用。据统计，约有十多种抗生素以一种或多种联合的形式采用粉剂、涂擦剂、注射剂，以及乳导管注入等方式加以应用，导致抗生素残留相当严重，在奶牛饲料中，也含有抗生素添加剂。许多抗生素如青霉素、四环素、磺胺类药物及某些氨基糖苷类抗生素等均具有抗原性，能使部分易感人群发生过敏反应。轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝组织炎等，严重时可出现喉头水肿、呼吸困难、过敏性休克，甚至危及生命；有些抗生素具有一定毒性，长期用药对服用者的肝肾功能具有一定损伤，甚至有致癌、致畸、致突变作用；并且可引起长期摄入者体内耐药菌增加，当有重大疾病需治疗时抗菌药物失效。牛奶中抗生素残留是当前原料奶中不容忽视的问题，控制残留的发生不仅需要对奶源进行有效管理，而且要建立先进的抗生素残留检测方法，从而加强奶源质量管理。

检测牛奶及其制品中抗生素残留有多种方法，如微生物检测法；理化检测法；免疫法等。微生物法是抗生素残留检测最早采用的方法，目前已有多种商品试剂盒，如Delvotest、CharmScien等，以及我国国标嗜热链球菌抑制法(又称TTC法)。

嗜热乳酸链球菌抑制法(TTC法)是GB/T 4789.27-2008中鲜乳中抗生素残留检验第一法，其中以嗜热链球菌作为指示菌，2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)作为指示剂。其方法原理是：样品经过80℃杀菌后，添加嗜热链球菌液，36±1℃培养2h后，加入TTC溶液，若乳样中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，嗜热链球菌将继续增殖，将TTC还原成为红色物质。相反，如果乳样中含有高于检测限的抗生素，则嗜热链球菌受到抑制，因此TTC不被还原，保持原色。关于指示菌量，TTC法的描述是：取一接种环活化的嗜热链球菌液至9mL脱脂灭菌脱脂乳中，培养15h，按1∶1稀释后使用。

由于不同的菌种活力、不同的菌液量等都会对TTC的还原反应产生非常大的影响，因此，对于同一份样品，不同的实验人员或着同一位实验人员在不同时间、不同批次的实验中经常会得出不同的实验结果。比如，当加入菌量过多时，会使抗生素含量低的乳样管变红，出现假阴性结果；当加入菌量过少时，在方法规定观察时间内对照管颜色不发生可见改变，无法判断最终结果，或导致假阳性结果增加。

以上种种原因都极大地限制了TTC法的推广及应用。本领域中也已经有部分研究人员开始着手于对国标TTC法的改进和优化，但是目前为止，依然没有较为精准的、能够较大程度且较全面地使假阴性、假阳性以及实验操作过程、耗时等各方面问题都得以显著改善的实验方案被披露。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用，该研究结果为TTC法试验的推广应用提供了一株方便易得的指示菌。